雞源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏分析

王欣宇，呂雪峰，任 銳，邵洪澤

（吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130062）

雞大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌（Escherichia coli）引起的一種細(xì)菌性傳染病，不同種類及日齡的雞群均可感染。感染后的主要癥狀為精神沉郁、腹瀉、關(guān)節(jié)腫脹、氣囊炎、肝周炎、心包炎、敗血癥等[1]。雞大腸桿菌病會(huì)造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降、雛雞發(fā)育不良等現(xiàn)象，是養(yǎng)雞業(yè)的常見(jiàn)病和高發(fā)病，還可繼發(fā)其他疫病。致病性大腸桿菌擁有眾多血清型。引起雞大腸桿菌病的血清型主要為O1、O2、O18、O78[2]。同一血清型中不同的菌株無(wú)交叉免疫保護(hù)性，難以通過(guò)疫苗進(jìn)行保護(hù)。多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)通過(guò)抗菌藥物對(duì)大腸桿菌進(jìn)行控制。抗生素一直以來(lái)是防控細(xì)菌病的首選藥物，隨著各種抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中的泛用和濫用，大腸桿菌的耐藥性不斷增強(qiáng)、耐藥譜變寬及多重耐藥菌株層出不窮，給大腸桿菌病的防治帶來(lái)困難[3]。2020年，本研究室先后在吉林省長(zhǎng)春市周邊地區(qū)分離出數(shù)個(gè)典型病例菌株，采用微生物鑒定、PCR 分類鑒定及藥敏試驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行敏感藥物篩選，以期更好地掌握其流行病學(xué)特點(diǎn)及耐藥情況，為養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中的用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 病料

病料取自吉林省長(zhǎng)春市，死亡雞剖檢癥狀疑似大腸桿菌感染，無(wú)菌采取病雞的肝臟、心臟等器官，裝于自封袋中密封，4 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.1.2 試劑

血瓊脂培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏陰性菌鑒定板購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 儀器

顯微鏡、電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、麥?zhǔn)媳葷醿x、AIM全自動(dòng)菌液接種儀均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離鑒定

無(wú)菌條件下取病死雞的肝臟、脾臟、心包液接種于血瓊脂培養(yǎng)基。37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取菌落形態(tài)明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，純化后挑取菌落形態(tài)明顯的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及生物學(xué)特性。挑取單個(gè)典型菌落劃線接種于大腸桿菌鑒定培養(yǎng)基中37 ℃增殖培養(yǎng)24 h，觀察其培養(yǎng)特性。

1.3 分離菌株生化試驗(yàn)

挑取分離菌株培養(yǎng)物加入無(wú)菌玻璃管，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)其濁度達(dá)到0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，此時(shí)菌液濃度約為1×108CFU/mL。用全自動(dòng)菌液接種儀將菌液接種于革蘭氏陰性菌鑒定板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)18 h，然后用ARIS 2X 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)[Thermo Scientific（賽默飛世爾）]進(jìn)行生化特性檢測(cè)。

1.4 致病性分型鑒定

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）和腸集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）[4]對(duì)應(yīng)毒力基因設(shè)計(jì)引物，由吉林省庫(kù)美生物公司合成，引物具體信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.2 PCR擴(kuò)增

粗提法提取經(jīng)過(guò)生化鑒定為大腸埃希氏菌的菌液DNA，用表1 合成的引物對(duì)分型基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。配制2.5%濃度瓊脂糖凝膠，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于加樣孔中，同時(shí)加入2000 bp DNA Marker，120 V電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.5 進(jìn)化分群鑒定

采用Clermont 等[5]所建立的四重PCR 檢測(cè)方法，依據(jù)arpA、chuA、TspE4.C2和YjaA基因設(shè)計(jì)合成4 對(duì)引物見(jiàn)表2，采用四重PCR的方法鑒定大腸桿菌。PCR反應(yīng)體系：2×SuperFi ⅡGreen PCR Master Mix 25 μl、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL、加Nuclease-Free Water 至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。配制1%濃度瓊脂糖凝膠，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于加樣孔中，同時(shí)加入2000 bp DNA Marker，120 V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。依據(jù)Clermont 等[5]建立的分群方法：B2群：chuA+、YjaA+；D 群：chuA+、YjaA-；B1群：chuA-、TspE4+.C2+；A群：arpA對(duì)本試驗(yàn)的菌株進(jìn)行分群分析。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.6 分離菌株藥敏試驗(yàn)

使用液體培養(yǎng)基將試驗(yàn)用菌株培養(yǎng)制備成細(xì)菌懸液，細(xì)菌濃度約為108CFU/mL。取100 μL 菌懸液，無(wú)菌操作選用一次性涂布棒均勻涂布于平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱中放置30 min，待菌液充分吸收，取出平板，將平板倒置，在背面用記號(hào)筆將平板劃分成面積相等的5部分并標(biāo)記。在無(wú)菌條件下，將小鑷子置于酒精燈火焰中灼烤滅菌，夾出6個(gè)濾紙片，分別置于標(biāo)記好的5部分及中心位置，等間距放置且有規(guī)律，將平板置于37 ℃恒溫箱箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果并用游標(biāo)卡尺測(cè)量紙片周圍抑菌圈直徑，參照藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株培養(yǎng)特性（見(jiàn)圖1、圖2）

由圖1 可知，菌落在血瓊脂培養(yǎng)基上形成比較大的灰白色菌落、多數(shù)不透明或邊緣輕微透明、菌落表面濕潤(rùn)、有特殊酸臭味。由圖2可知，大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出藍(lán)綠色菌落、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)形態(tài)。

圖1 血瓊脂培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of blood culture medium

圖2 大腸桿菌顯色培養(yǎng)基菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Escherichia coli chromogenic medium

2.2 菌株染色鏡檢結(jié)果（見(jiàn)圖3）

由圖3 可知，分離菌株革蘭氏染色鏡檢顯示為粉紅色的兩端鈍圓短小桿菌，符合大腸桿菌的染色特點(diǎn)。

圖3 菌株革蘭氏染色鏡檢Fig.3 Gram staining microscopic examination of strains

2.3 菌株生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

由表3可知，分離菌能發(fā)酵山梨醇、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖，符合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中大腸桿菌生化反應(yīng)特性，由此可判定分離菌株為大腸埃希氏菌。

表3 菌株生化鑒定結(jié)果Tab.3 Results of biochemical test of strains

2.4 菌株致病性分型鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖4）

由圖4可知，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳可以觀察到488、322、254 bp 的stx、elt、agg R特異性電泳條帶，根據(jù)毒力基因可知，分離菌株主要為腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、和腸集聚性大腸埃希氏菌（EAEC），ETEC 檢出4 株，占比57%（4/7）；EIEC 檢出4 株；占比57%（4/7）；EAEC檢出1株；占比14%（1/7），未檢出腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）和腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）。

圖4 致病性分型PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR product of diarrheagenic Escherichia coli

2.5 菌株進(jìn)化分群鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖5）

圖5 大腸桿菌的多重PCR分群Fig5 Multiplex PCR clustering of Escherichia coli

由圖5可知，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳可以觀察到400、288、211 bp 的arpA、chuA、YjaA特異性電泳條帶，進(jìn)行PCR條帶比對(duì)，確定致病性大腸桿菌菌株的系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果為B2群1 株，占14.3%（1/6）；其余6 株為A 群，占85.7%（6/7）。

2.6 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4）

由表4可知，對(duì)臨床上經(jīng)常使用的抗菌藥物如青霉素、紅霉素、氧氟沙星等表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性；本次分離出的雞大腸桿菌病僅對(duì)大觀霉素敏感性較高，卡那霉素次之。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of antimicrobial test susceptibility test

3 討論

通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察及微生物鑒定，確定分離到的菌株為大腸埃希氏菌。致病性分型結(jié)果表明，本次分離的吉林省長(zhǎng)春市菌株主要以ETEC和EIEC為主，同時(shí)還有少量的EAEC。腸產(chǎn)毒性大腸桿菌是一類能侵染小腸上皮細(xì)胞的病原菌，能夠在細(xì)胞上定植和增殖，并產(chǎn)生腸毒素。腸毒素是由質(zhì)?；蛉旧w編碼的，具有熱敏感或熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)[6]。腸侵襲性大腸桿菌是一類具有強(qiáng)致病毒力的病原菌，主要引起水樣腹瀉和痢疾。但本研究的分型鑒定結(jié)果及分離率和我國(guó)以往的大腸桿菌流行病學(xué)研究不一致，可能是由于在不同地域和其他因素的作用下，致病性大腸桿菌在動(dòng)物體內(nèi)的分離率也有變化。

藥敏試驗(yàn)表明，分離菌株對(duì)青霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林等多種抗生素產(chǎn)生耐藥性；只對(duì)大觀霉素、卡那霉素敏感，與張青青等[7]、于靜晨等[8]等報(bào)道一致，說(shuō)明臨床中禽源大腸桿菌的耐藥情況較為嚴(yán)重。由于臨床抗生素的泛用、亂用導(dǎo)致大腸桿菌多重耐藥性，有必要根據(jù)藥物篩選結(jié)果選擇最敏感的藥物，盲目濫用只會(huì)導(dǎo)致耐藥性進(jìn)一步加重。

致病性大腸桿菌在不同動(dòng)物體內(nèi)按不同比率分布，大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群可以分為4個(gè)群：A、B1、B2、D，依靠出現(xiàn)arpA、chuA、yjaA基因和TspE4.C2非編碼區(qū)區(qū)分。雞源大腸桿菌主要出現(xiàn)在A群和D群。本試驗(yàn)85.7%的A群檢出率與之前研究中結(jié)果相一致[9]，一定程度上說(shuō)明我省禽致病性大腸桿菌在系統(tǒng)進(jìn)化分群上的特點(diǎn)。

大腸桿菌病作為養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)疫病，以預(yù)防為主，由于養(yǎng)殖過(guò)程中青霉素等抗生素藥物的廣泛使用，導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)其產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，飼料中添加的喹乙醇及氯霉素等也加劇耐藥菌株的產(chǎn)生[10]。本研究中，菌株對(duì)大觀霉素、卡那霉素敏感可以為吉林省雞源大腸桿菌的防治提供參考。

4 結(jié)論

吉林省內(nèi)的雞源致病性大腸桿菌多以A型為主，且具有多重耐藥性，可以嘗試使用大觀霉素、卡那霉素治療雞大腸桿菌病。