鹽酸二甲雙胍對Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子s表達的影響及機制

楊 朋，錢 軍，陳文飛，鄧懷冬

(攀枝花學院附屬醫(yī)院藥劑科，四川攀枝花 617000)

神經(jīng)退行性疾病是當前威脅老年人生命健康的最主要危險因素之一，而神經(jīng)炎癥與包括阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)、帕金森疾病(parkinson’s disease, PD)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。神經(jīng)炎癥的發(fā)生主要與大腦內(nèi)固有的免疫細胞小膠質(zhì)細胞的過度活化有關(guān)，過度激活的小膠質(zhì)細胞釋放大量的促炎性因子，產(chǎn)生神經(jīng)元毒性，導致神經(jīng)元凋亡，從而損壞認知功能[3]。因此，控制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥將有助于神經(jīng)退行性疾病的改善和治療[4-5]。

鹽酸二甲雙胍(metformin, Met)是臨床治療2型糖尿病的一線用藥，能顯著改善胰島素抵抗和降低血糖，還具有抗腫瘤、抗炎及心血管保護效應，并且能透過血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護效應[6-8]。然而，Met能否抑制神經(jīng)炎癥及其抗神經(jīng)炎癥的潛在機制尚不明確。因此，本研究用Aβ1-42誘導BV-2細胞建立神經(jīng)炎癥模型，分別從分子、基因及蛋白水平探究Met對炎性因子表達的影響及分子機制，以期為Met治療神經(jīng)炎癥性疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料Met(Sigma，純度99%，貨號PHR1084)，Aβ1-42、MTT(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，PCR試劑盒(QIAGEN公司)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 RT-PCR引物(Invitrogen)，NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、p-IκB、IκB抗體、RIPA裂解液(Cell Signaling Technology)，β-actin抗體、HRP標記山羊抗鼠抗體、HRP標記山羊抗兔抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蛋白濃度檢測試劑盒(Bio-Rad)，高敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 實驗儀器多功能酶標儀(Bio-Tek)，熒光定量PCR儀、凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.3 實驗方法

1.3.1藥物處理稱取適量Aβ1-42溶于滅菌后的PBS中，配成200 μmol/L的儲備液保存于-80 ℃冰箱中，臨用前置于37 ℃孵育7 d，使其成為聚集狀態(tài)。稱取適量Met溶于滅菌后的PBS中，配成1 mol/L的儲備液，保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2細胞培養(yǎng)BV-2細胞(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫)培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3.3細胞分組及處理取對數(shù)生長期的BV-2細胞接種至96孔板(8 000/孔)或6孔板(20萬/孔)，將細胞分為對照組、模型組(5 μmol/L Aβ1-42)、Met低劑量組(5 μmol/L Aβ1-42+0.5 mmol/L Met)、Met中劑量組(5 μmol/L Aβ1-42+1 mmol/L Met)、Met高劑量組(5 μmol/L Aβ1-42+2 mmol/L Met)。對照組用培養(yǎng)基培養(yǎng)，不用任何藥物處理；模型組用5 μmol/L Aβ1-42處理24 h；Met低劑量組、Met中劑量組、Met高劑量組先用對應濃度的Met預處理6 h，然后再將培養(yǎng)基替換成含5 μmol/L Aβ1-42和對應濃度Met的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4MTT法檢測Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，以8 000/孔接種至96孔板，每孔100 μL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日棄上清，按照1.3.3項分組方法處理各組細胞；檢測Met對BV-2細胞活力的影響時，將細胞分為對照組和Met組，對照組正常培養(yǎng)，不用任何藥物處理，Met組直接用對應濃度的Met干預48 h。干預結(jié)束后棄上清，加入含0.5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)基100 μL，在培養(yǎng)箱中孵育3 h后棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上振搖10 min，然后用多功能酶標儀檢測吸光度(A)，檢測波長為570 nm。根據(jù)吸光度(A)計算各組相對細胞活力。

1.3.5ELISA法檢測Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子表達的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，以8 000/孔接種至96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜。次日棄上清，開始用藥物干預，分組及干預方式同1.3.3項，干預結(jié)束后取上清按ELISA試劑盒說明書方法檢測各組上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量。

1.3.6RT-PCR法檢測Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA表達的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，以20萬/孔接種至6孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)過夜。次日棄上清，分組及干預方式同1.3.3項。干預結(jié)束后棄上清，按總RNA提取試劑盒說明書提取各孔細胞總RNA，檢測濃度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板根據(jù)PCR試劑盒說明書方法檢測各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平，引物序列見表1。

1.3.7Western blotting法檢測Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞p-IκBα、IκBα、NF-κB、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表達的影響 取對數(shù)生長期的BV-2細胞，以20萬/孔接種至6孔板，培養(yǎng)過夜。次日棄上清，分組及干預方式同1.3.3項。干預結(jié)束后棄上清，PBS潤洗2遍，棄PBS，每孔加入60 μL RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，刮下細胞，將細胞與裂解液一起轉(zhuǎn)移到1.5 mL無酶離心管中，置于4 ℃離心機中12 000 r/min離心10 min，然后收集上清液，檢測蛋白濃度后加入5× Loading buffer，95 ℃加熱5 min，冰上驟冷，然后上樣30 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，然后用100 mL/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗凈牛奶，一抗4 ℃孵育過夜。次日棄一抗，TBST洗滌3次，每次5 min，然后二抗室溫孵育1 h，棄二抗，TBST洗滌3次，每次5 min，然后用ECL發(fā)光檢測試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件定量分析圖像。

2 結(jié) 果

2.1 Met對BV-2細胞活力的影響實驗結(jié)果表明，0.5、1、2 mmol/L的Met干預BV-2細胞48 h后的細胞活力與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義，提示0.5、1、2 mmol/L的Met在48 h內(nèi)對BV-2細胞無明顯毒性。1.25、2.5、5 μmol/L的Aβ1-42誘導BV-2細胞24 h后細胞活力呈劑量依賴性下降(P<0.01)，表明其可不同程度地損傷BV-2細胞。Met和Aβ1-42共同處理BV-2細胞相對于單獨用Aβ1-42處理的BV-2細胞活力顯著升高，說明Met可改善Aβ1-42誘導的BV-2細胞活力損傷(圖1)。

與對照組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

2.2 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子表達的影響為探究Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子表達的影響，采用Met和Aβ1-42處理BV-2細胞，通過ELISA法檢測各組細胞上清液中炎性因子含量。結(jié)果顯示，BV-2細胞經(jīng)Aβ1-42誘導后，上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的含量均顯著升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Met干預后，上清液中炎性因子的含量均呈劑量依賴性下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2)，表明Met可抑制Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子的表達。

2.3 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平的影響為探究Met對炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響，通過RT-PCR法檢測各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA的相對水平。結(jié)果顯示，BV-2細胞經(jīng)Aβ1-42誘導后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Met干預后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平呈劑量依賴性下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)，表明Met可抑制Aβ1-42誘導的BV-2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的轉(zhuǎn)錄。

2.4 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達的影響為進一步探究Met抑制Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎癥反應的分子機制，采用Western blotting檢測NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表達情況。結(jié)果顯示，Aβ1-42可促進NLRP3、ASC、Caspase-1(p20)表達，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；0.5 mmol/L Met干預后，NLRP3、ASC、Caspase-1(p20)表達水平與模型組相比有輕微下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)；1 mmol/L Met干預后，NLRP3、Caspase-1(p20)表達水平與模型組相比顯著下降(P<0.01)，而ASC表達水平變化不明顯(P≥0.05)；2 mmol/L Met干預后，NLRP3、ASC、Caspase-1(p20)表達水平與模型組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4)。上述結(jié)果表明，Met可劑量依賴性地抑制Aβ1-42誘導的NLRP3炎性小體激活。

圖2 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子表達的影響Fig.2 Effect of Met on the expressions of inflammatory cytokines in BV-2 cells induced by Aβ1-42 (n=3 in each group)與對照組相比,*P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01。

圖3 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA水平的影響Fig.3 Effect of Met on TNF-α, IL-1, IL-6 and IL-18 mRNA levels in BV-2 cells induced by Aβ1-42 (n=3 in each group)與對照組相比,*P<0.01;與模型組相比,#P<0.01。

圖4 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Met on the protein expressions of NLRP3, ASC and Caspase-1 in BV-2 cells induced by Aβ1-42 (n=3 in each group)與對照組相比,*P<0.01;與模型組相比,#P<0.01。

2.5 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的影響NLRP3炎性小體的活化受NF-κB通路的調(diào)控，因此本研究進一步檢測了NF-κB、p-IκBα、IκBα蛋白表達情況。結(jié)果顯示，Aβ1-42可顯著促進NF-κB、p-IκBα表達，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；0.5、1、2 mmol/L的Met干預后，NF-κB、p-IκBα表達水平均明顯下降(P<0.01)，但未呈現(xiàn)典型的劑量依賴效應(圖5)。上述結(jié)果表明，Met可抑制Aβ1-42誘導的NF-κB通路激活。

圖5 Met對Aβ1-42誘導的BV-2細胞p-IκBα、IκBα、NF-κB(p65)蛋白表達的影響

3 討 論

小膠質(zhì)細胞是大腦中的固有吞噬細胞，通過清除大腦中的病原體、異常蛋白和細胞碎片維持大腦穩(wěn)態(tài)[9]。當神經(jīng)元死亡、異常蛋白聚集等病理因素激活小膠質(zhì)細胞后，小膠質(zhì)細胞迅速向病變部位遷移并立即啟動先天免疫反應從而維持機體正常功能[9]，但持續(xù)過度激活小膠質(zhì)細胞則會導致小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等促炎因子，加重腦內(nèi)炎癥反應，引起神經(jīng)元死亡，最終導致AD、PD、ALS等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid, Aβ)過度沉積引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應被認為是AD發(fā)病的重要原因[10]。Aβ可激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)導進入細胞核，啟動IL-1β、IL-18等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，促進神經(jīng)炎癥的發(fā)生[11-12]。此外，Aβ還可激活PARP、升高Bax/Bcl-2比值誘導細胞凋亡[12]。因此，本研究采用Aβ誘導BV-2細胞建立體外神經(jīng)炎癥模型，實驗結(jié)果表明，Aβ1-42可劑量依賴性地降低BV-2細胞活力，這可能與其導致的炎癥因子大量釋放進而誘導細胞凋亡有關(guān)[12]。

NLRP3炎性小體是炎癥反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其結(jié)構(gòu)組成包括NLRP3、接頭蛋白(ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)[13-14]。當NLRP3炎性小體被激活后可釋放Caspase-1并促進其轉(zhuǎn)化為活化形式，活化的Caspase-1將無活性的pro-IL-1β和pro-IL-18剪切成具有活性的IL-1β和IL-18，IL-1β和IL-18的過度釋放則加重炎癥反應，對膠質(zhì)細胞周圍的神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，導致神經(jīng)元凋亡，進而導致認知功能衰退[15]。本研究的結(jié)果表明，Aβ1-42可促進NLRP3炎性小體的活化并導致IL-1β和IL-18的分泌增加，這與TERRILL-USERY等[16]的研究一致；此外，本研究的結(jié)果亦表明，Met可顯著抑制NLRP3炎性小體的活化并減少IL-1β和IL-18的分泌，說明Met抑制BV-2細胞的炎癥反應可能與抑制NLRP3炎性小體的激活有關(guān)。NF-κB對炎癥因子、黏附分子、生長因子等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用，其信號轉(zhuǎn)導通路主要包括NF-κB、NF-κB抑制蛋白(inhibitory nuclear factor-κB, IκB)和IκB激酶(IκB kinase, IKK)，IκB可通過與NF-κB結(jié)合抑制其活性，當IκB被IKK磷酸化后失去活性，進而釋放NF-κB使其激活，活化的NF-κB則可易位至胞核促進靶基因的轉(zhuǎn)錄[17-19]。本研究表明，Aβ1-42可通過促進IκB磷酸化從而激活NF-κB，活化的NF-κB可促進NLRP3的轉(zhuǎn)錄，這很可能是Aβ1-42加重BV-2細胞炎癥反應的又一機制。這一結(jié)果與LIU等[20]在視網(wǎng)膜色素上皮細胞的研究中得到的結(jié)果一致。Met處理后，Aβ1-42介導的IκB磷酸化明顯被減弱，NF-κB活性被抑制。Met對NF-κB信號的抑制作用在食管鱗癌中也得到了證實[21]。

Met作為臨床治療糖尿病的一線藥物，在長期的臨床應用中被發(fā)現(xiàn)還具有神經(jīng)保護、抗炎、抗腫瘤等作用[6-8,22-24]。Met作為AMPK的激活劑，PAN等[8]發(fā)現(xiàn)，Met可通過激活AMPK抑制小膠質(zhì)細胞活化，另外，由于激活AMPK信號還可增強自噬活性，可能有益于Aβ的清除，進而減弱Aβ誘導的神經(jīng)炎癥反應[25]。GE等[22]發(fā)現(xiàn)，Met可通過PI3K/Akt1/JNK3途徑抑制缺血/再灌注損傷導致的海馬神經(jīng)元凋亡，從而改善大鼠認知功能。TAO等[26]發(fā)現(xiàn)，Met可通過NF-κB通路抑制創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經(jīng)炎癥反應。本研究的結(jié)果表明，0.5、1、2 mmol/L的Met可顯著抑制IκB磷酸化進而抑制NF-κB的活性，同時還可劑量依賴性地抑制Aβ1-42對NLRP3炎性小體的活化作用，減少TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的表達與釋放，并最終發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥的作用。本研究的結(jié)果為Met抑制小膠質(zhì)細胞活化，減弱神經(jīng)炎癥反應，從而發(fā)揮神經(jīng)保護效應提供了新的實驗證據(jù)。不足的是，本研究僅在體外水平證實了Met抑制神經(jīng)炎癥的效果，尚缺乏體內(nèi)研究，后續(xù)將通過動物實驗研究Met抑制神經(jīng)炎癥的體內(nèi)效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Met可抑制Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的轉(zhuǎn)錄與釋放，發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥效果，Met抑制神經(jīng)炎癥的作用與下調(diào)NF-κB信號通路抑制NLRP3炎性小體的活化有關(guān)。本研究為Met的神經(jīng)保護作用提供了新的實驗證據(jù)，將對Met治療神經(jīng)炎癥性疾病提供新的見解和依據(jù)。