• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高效原油污染降解菌的篩選、鑒定及菌群的構(gòu)建

    2021-05-14 06:01:28朱淑芳EHENEDENIyobosa寧海軍尚潔昊李武陽孟憲剛
    生物技術(shù)通報 2021年4期
    關(guān)鍵詞:桿菌屬稠油單胞菌

    朱淑芳 EHENEDEN Iyobosa 寧海軍 尚潔昊 李武陽 孟憲剛

    (蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,蘭州 730070)

    石油是地下巖石中生成的、液態(tài)的、以碳氫化合物為主要成分的可燃性礦產(chǎn),且直接從油井中開采出來未加工的石油稱為原油[1]。原油按組成分類分為蠟基原油、環(huán)烷基原油和中間基原油3類。石蠟基原油中烷烴較多;環(huán)烷基原油含環(huán)烷烴、芳香烴較多;中間基原油介于二者之間[2];根據(jù)相對密度分為重質(zhì)原油(d420,0.9-1.0)和低質(zhì)原油(d420,0.77-0.85),重質(zhì)原油也稱為稠油,稠油與普通原油相比,膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的含量較高[3]。由于原油中含有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴、含硫化合物等,其芳香烴中一些苯系物(甲苯、乙苯和二甲苯)揮發(fā)性大,在原油的加工、運輸、儲存過程中容易釋放到環(huán)境中,會對人體的血液、神經(jīng)系統(tǒng)具有較強危害[4]。硫化物是形成酸雨的主要原因,SO2有刺激性氣味,人吸入后會導(dǎo)致肺水腫甚至死亡[5]。

    石油在開采、加工、運輸過程中難免會產(chǎn)生石油污染物,石油污染已經(jīng)成為我國突出的環(huán)境問題之一[6-7]。目前,工業(yè)上大多數(shù)都是用物理化學(xué)法處理原油污染物,而物理化學(xué)法處理成本高,存在二次污染。所以,以原油為唯一碳源,利用微生物降解原油污染物成了研究的熱點。據(jù)研究報道,降解石油烴的微生物有200多種,其中,細菌對原油的降解能力優(yōu)于真菌和放線菌[8]。常見原油降解菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、產(chǎn)堿桿菌屬等(Alcaligenes)[9-10]。但這些菌株大都針對部分石油烴成分或者是輕質(zhì)原油,對于高黏度、高密度稠油的降解效果不是很顯著。例如,宋永亭等[11]從油田采出水篩選得到一株枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis sp.)S,在37℃、120 r/min對稠油處理14 d后,該菌株對瀝青質(zhì)降解率達34.87%。賈群超等[12]從石化廠周圍的油泥中分離到兩株不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)GS02和 GS07,將 1 g/L的稠油處理5 d后,降解率分別為45.3%和46.1%。任妍君等[13]用從稠油污染土壤中分離得到一株彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)DL1-G對稠油處理9 d后,該菌株對稠油的降解率39.89%。因此,篩選得到潛在的高效原油菌株對原油污染物的處理是至關(guān)重要的。本實驗以山東原油污染污泥為研究對象,從實驗室自有菌株及從污染源中分離出原油降解菌株,通過原油降解試驗檢測菌株對原油的降解能力,旨在篩選出原油高效降解菌株,并通過正交實驗得到原油降解高效菌群,旨為石油污染物的生物法治理提供優(yōu)秀的的烴降解菌株資源。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗材料 山東某油田的含油污泥、實驗室自有菌種、山東某油田污染土壤。

    1.1.2 試劑 牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);蛋白胨(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);氯化鈉(廣東光華科技股份有限公司);七水合硫酸鎂(廣東光華科技股份有限公司);七水合硫酸亞鐵(天津市蘇莊化學(xué)試劑廠);磷酸二氫鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠);硝酸銨(萊陽化工試驗廠);三氯化鐵(煙臺市雙雙化工有限公司);硫酸銨(天津市北辰方正試劑廠);硝酸鈉(天津市百世化工有限公司);一水合磷酸二氫鈉(天津市北辰方正試劑廠);硫酸銅(天津市化工三廠有限公司);氯化鈣(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

    1.1.3 儀器 SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);SPX型智能生化培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司);TGL-16G離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9012)(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);電子天平(FA2004N)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);雙功能水浴恒溫振蕩器(常州天瑞儀器有限公司)。

    1.1.4 培養(yǎng)基 NA液體培養(yǎng)基[14]:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.8-7.2,121℃滅菌20 min。NA固體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.8-7.2,121℃滅菌 20 min。SY 培養(yǎng)基[15]:初 篩 KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NH4NO31 g,CaCl20.02 g,F(xiàn)eCl3痕量,原油2 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2-7.4,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。GJ培養(yǎng)基[15]:用于石油降解(NH4)2SO40.5g,NaNO30.5 g,KH2PO41 g,NaH2PO4·H2O 1 g,微量元素液 2 mL,pH 7.0,原油2 g,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。微量元素液:ZnSO40.1%,CaCl20.1%,CuSO40.15%,MgSO4·7H2O 0.4%,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15%。

    1.2 方法

    1.2.1 菌源的制備及富集培養(yǎng) 參考文獻[15]中的方法,取10 g油泥溶于90 mL的無菌水中,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖4 h后,靜置沉淀2 h,以上清液作為菌源,取2 mL上清液加入富集培養(yǎng)基中,以轉(zhuǎn)速150 r/min,30℃恒溫培養(yǎng)136 h,再吸取5 mL渾濁培養(yǎng)液加入到新鮮的SY培養(yǎng)基中,按上述條件連續(xù)培養(yǎng)3-4次,實現(xiàn)降解石油烴菌的富集。

    1.2.2 高效菌株的分離純化 將上述1.2.1中制得的菌懸液取5 mL接種于GJ培養(yǎng)基中,在30℃,150 r/min的培養(yǎng)條件下,用恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至GJ培養(yǎng)基渾濁,吸取1 mL做梯度稀釋涂布接種于石油平板上,30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d,在NA培養(yǎng)基中反復(fù)劃線純化后得到單一菌落。

    1.2.3 高效菌株的定性篩選 用2,6-二氯酚靛酚(2,6-dichlorophenol indophenol,DCPIP)方法[16-17]篩選石油降解菌株,純化后的菌株用初始發(fā)酵培養(yǎng)基(150 r/min、30℃)發(fā)酵培養(yǎng)48 h,10 000 r/min離心15 min,然后用0.85% NaCl 溶液洗滌兩次,調(diào)整其OD600為1。取一離心管并在其中加入200 μL GJ培養(yǎng)基(未添加石油)、30 μL 石油、20 mg/L DCPIP 作為氧化還原指示劑,加30 μL 經(jīng)上述處理的菌液后,在30℃下培養(yǎng)72 h,通過DCPIP顏色的變化作為衡量菌株降解石油的能力標準。每株菌株做3組平行樣。

    1.2.4 高效菌株的16S rRNA基因序列的擴增及測定 將分離篩選的菌株分別接種于NA液體培養(yǎng)基中,30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期或穩(wěn)定期,菌液渾濁。每個菌株分別取2 mL 菌液于離心管中,12 000 r/min 離心2 min,棄上清液留菌體,向離心管中加入500 μL無菌雙蒸水,渦旋30 s,置95℃水浴 5 min,12 000 r/min離心2 min。以上清液作為模板[18]。

    采用細菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R :5′-TACGACTTAACCCCAATCGC -3′對分離得到的菌株進行PCR擴增。反應(yīng)體系(25 μL):PCR MIX 12.5 μL,上下游引物各 0.5 μL,ddH2O 10.5 μL,模板 1 μL,擴增程序為 :95℃預(yù)變性5 min,進入PCR循環(huán),94℃變性45 s,54℃退火 1.5 min,72℃延伸 10 min[19]。

    1.2.5 高效菌株的定量篩選 將從1.2.4中篩選得到的菌株在NA培養(yǎng)基中進行活化,使菌液的OD600值為1,吸取8 mL菌液接種到含油量為0.25%的GJ培養(yǎng)基中,150 r/min、30℃下培養(yǎng)7 d后用重量法檢測石油的降解率,每組試驗3個平行,取平均值。

    1.2.6 重量法檢測原油的降解率 參照 Gao等[20]的方法用重量法測定菌株對石油的降解率,用三氯甲烷萃取1.2.5中培養(yǎng)7 d后的處理液,在每個處理試樣中加入30 mL三氯甲烷,全部移入分液漏斗后充分搖勻,并靜置,待完全分層后,收集下相,再用三氯甲烷萃取3-4次,合并下相,并用無水Na2SO4脫水干燥,放入烘箱中60℃烘干冷卻后稱重,以不加菌株的處理為空白對照,計算降解率,每組試驗3個平行,取平均值。

    降解率 =[(m0-m1)÷m0]×100%

    m0:對照組的殘油重量(g);m1:降解后樣品的殘油重量(g)。

    1.2.7 高效菌群的構(gòu)建 采用九因素三水平的方式通過正交實驗進行菌群構(gòu)建。將9種菌設(shè)為9種因素,每種菌設(shè)置3個接種量(0、0.5、1)作為三水平。將各個菌株分別接入NA液體培養(yǎng)基,直至OD600為1。稱取0.2 g固體原油,放入裝有80 mL GJ培養(yǎng)基的150 mL三角燒瓶,121℃高溫殺菌20 min。將各個菌體按照構(gòu)建組合和比例分別接入培養(yǎng)基中,各個構(gòu)建和組合均做3組平行。在30℃,150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中降解7 d,測定原油降解率。選出最佳降解菌群。

    2 結(jié)果

    2.1 高效菌株的分離純化

    對所采集的樣品經(jīng)過富集培養(yǎng)以及初篩,分離純化得到9株微生物,分別編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7、SF8和 SF9, 且 發(fā) 現(xiàn) 菌 株SF1、SF2、SF7、和SF9的菌株生長較快,菌落形態(tài)較大,如圖1所示。

    2.2 DCPIP篩選高效菌株

    用DCPIP對上述分離的9株微生物進行顯色篩選。由圖2可知,所有菌株在經(jīng)過不同的時間后,DCPIP由藍色完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色,說明這9株菌株對石油有較強的降解能力,在圖2-A中,菌株SF3、SF7、SF8在24 h后由藍色變?yōu)闊o色,在圖2-B中菌株SF1、SF2、SF9在48 h后由藍色變?yōu)闊o色,而圖2-C中而菌株SF4、SF5、SF6在72 h后藍色變?yōu)闊o色,在未添加微生物的離心管,DCPIP未變色。Varjani Sunita等用該方法從石油污染的土壤和水中分離出6株石油降解菌株,最短120 h內(nèi)可使DCPIP由藍色變?yōu)闊o色。這是因為石油、多環(huán)芳烴以及烷烴等碳氫化合物的降解氧化情況可用氧化還原指示劑DCPIP 進行評估,其主要功能在于可靈敏地反應(yīng)碳氫化合物初步氧化過程。通常 DCPIP 在氧化態(tài)時呈深藍色,將其添加至微生物降解石油的培養(yǎng)基中,其作為電子受體接受碳氫化合物氧化時所產(chǎn)生的電子從而變?yōu)闊o色。

    圖1 原油降解菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of crude oil-degrading strains

    圖2 DCPIP定性篩選原油降解菌株Fig.2 Qualitative screening of crude oil-degrading strains by DCPIP

    2.3 高效菌株的序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    對分離篩選得到的9株微生物進行DNA的提取,并進行PCR擴增且測序,序列經(jīng)NCBI中的blast比對分析,篩選菌株與相似菌株的同源性都高達95%以上,鑒定 SF1為中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium),SF2 為腸桿菌(Enterobacter sp.),SF3為不動桿菌(Acinetobacter sp.),SF4為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),SF5為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri),SF6假單胞菌(Pseudomonas sp.),SF7為 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌(Acinetobacter calcoaceticuspartial sequence),SF8為 霍 氏 腸 桿 菌(Enterobacter hormaecheipartial sequence),SF9 為松嫩平原假單胞菌(Pseudomonas songnenensis)。并將這些菌株基于16S rRNA序列的進化樹分析。由圖3所示,系統(tǒng)發(fā)育樹自展值均大于85%,證明該系統(tǒng)發(fā)育樹可信度高。

    2.4 原油降解試驗及降解率的測定

    將9株微生物的發(fā)酵液,按10%的接種量接入以石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中,進行搖瓶降解試驗,7 d后,結(jié)果如圖4所示:與對照相比,添加微生物的油膜消失,并將原油分解成小油滴,且原油的貼壁力有不同程度的下降,說明此微生物能利用原油為碳源作為營養(yǎng)物質(zhì),將大分子原油降解成小分子,或分解成二氧化碳和水。從圖5可知,菌株中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)SF1降解能力最強,降解率達48.73%,菌株腸桿菌(Enterobacter sp.)SF2、醋酸鈣不動桿菌SF7(Acinetobacter calcoaceticus)、松嫩平原假單胞菌SF9(Pseudomonas songnenensis)的降解能力略低于菌株SF1,降解率分別為41.90%、45.35%、32.25%,其他菌株的降解率也高于20%。

    2.5 高效菌群的構(gòu)建

    由正交實驗設(shè)計,得到了27種菌群組合。通過不同混合菌群對原油的降解試驗效果可以得出,有的混合菌群的降解效果優(yōu)于單個菌株的降解效果。這可能是因為菌株之間存在一定的協(xié)同作用,促進降解石油烴相關(guān)酶的活性,而也有混合菌群的降解能力低于單個菌株的降解效果,這可能是菌株之間的競爭抑制作用造成的。由表1可以得到菌株間的最佳組合形式以及菌株之間的添加比例,從實驗結(jié)果可以看出組合9的降解效果最好,對原油的降解率高達57.88%,最低的降解效率是組合18也就是空白實驗,原油降解效率為2.50%。組合9是為最佳高效菌群,由菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2 組成。

    圖3 原油降解菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of crude oil-degrading strain

    圖4 搖瓶發(fā)酵降解原油試驗Fig.4 Crude oil degradation experiment by shaking flask fermentation

    3 討論

    圖5 不同菌株對原油的降解率Fig.5 Degradation rate of crude oil by different strains

    目前,國內(nèi)外研究學(xué)者已獲得原油降解菌株有100多個屬,200個種[21]。本研究獲得的不動桿菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬是常見的原油降解菌株[22],并且大量研究表明不動桿菌屬和假單胞菌屬、腸桿菌屬對輕質(zhì)原油具有很好的降解效果[23-25]。不動桿菌屬細菌對石油烴中烷烴的降解效果最好,降解烷烴一般通過脂肪酸 β氧化[26];而假單胞菌屬細菌則對芳香烴的降解效率較高[27],國內(nèi)外對腸桿菌屬在降解原油機理方面的報道相對較少。藍慧等[28]分離的腸桿菌屬在pH 8.91、NaCl 濃度為1.19%、溫度為36.78℃以200 r/min的條件下對含油量為1%的培養(yǎng)基振蕩處理7 d后,對原油的降解率34.60%,而本文篩選的腸桿菌屬對原油的降解率高達41.90%,優(yōu)于藍慧等分離的腸桿菌屬,可能是由于pH和含氧量的不同直接影響到了微生物的生長,從而間接的影響到石油烴的降解;溫度的改變可以使石油污染物的黏度和溶解性發(fā)生變化,也能影響到微生物的生長狀況和其體內(nèi)的酶活性,從而影響石油的整個降解過程。周婷等[29]分離的不動桿菌屬在30℃、150 r/min的條件下對4 g/L的原油培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后,該菌株對原油的降解率達42.15%,與本研究篩選的不動桿菌屬相比,本研究篩選的不動桿菌更有利于原油的降解,因為本研究在30℃、150 r/min的條件下,處理7 d后,對原油的降解率高達45.35%,因此本研究篩選的不動桿菌更有利于原油的降解。中間蒼白桿菌屬對原油的降解報道不是很常見,尤其對相對密度大的原油降解報道罕見。高鵬飛等[30]從煉油廢水中篩選出的一株高效降解石油烴菌株蒼白桿菌(Ochrobactrum ciceri),該菌株對含柴油濃度為4 000 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基在120 r/min、30℃下振蕩處理6 d后,結(jié)果顯示,石油烴降解率高達98.98%。本實驗分離的蒼白桿菌屬SF1在2.5 g/L的原油培養(yǎng)基中7 d后,對原油的降解率為48.37%。從降解率看高鵬飛等篩選的蒼白桿菌屬對原油的降解效果優(yōu)于本實驗篩選得到的蒼白桿菌屬,但柴油屬于輕質(zhì)原油,黏度比稠油小,更易于微生物的降解。

    表1 高效菌群對原油的降解率Table 1 Degradation rate of high-efficiency bacteria on crude oil

    自然環(huán)境中的微生物多種多樣,石油的降解是一個極為復(fù)雜的過程,單個菌株很難實現(xiàn)原油組分的全部降解,構(gòu)建高效菌群可以結(jié)合各單個菌株的降解能力而形成一個較完整的降解體系,發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用,實現(xiàn)對原油的高效降解[31-32]。本研究通過正交實驗設(shè)計得到最佳高效菌群的構(gòu)建,結(jié)果 表 明, 菌 株 SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2組成的菌群對原油的降解效果優(yōu)于單個菌株,降解率達57.88%。而王海峰等[33]將分離得到的16株稠油降解菌株(紅球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等)進行等比列混合,對含油量1 000 mg/L的培養(yǎng)基處理7 d,結(jié)果顯示,該混合菌群對稠油的降解率為68%,該菌群對原油的降解效果優(yōu)于本研究構(gòu)建的高效菌群。可能是因為菌株的種類、比列及含油量的不同導(dǎo)致的,若含油量過高,使C∶N∶P值失衡,造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,影響菌株的生長,進而影響對原油的降解;也有可能原油濃度過大時,阻隔了菌體與氧氣的接觸,導(dǎo)致菌體不能良好的生長,從而使降解率下降。

    4 結(jié)論

    本研究從原油污泥、實驗室自有菌株以及原油污染的土壤中分離篩選出9株微生物,分別為SF1中間蒼白桿菌屬(Ochrobactrum intermedium),SF2、SF8屬于腸桿菌屬(Enterobacter sp.),SF3、SF7為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.),SF4、SF5、SF6、SF9屬于假單胞菌菌屬(Pseudomonas sp.)。通過對2.5 g/L的原油進行搖瓶實驗發(fā)現(xiàn),蒼白桿菌 屬(Ochrobactrum intermedium)SF1降 解 能 力最強,降解率達48.73%,腸桿菌屬(Enterobacter sp.)SF2、 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌 SF7(Acinetobacter calcoaceticus)、松嫩平原假單胞菌SF9(Pseudomonas songnenensis)的降解能力略低于菌株SF1,降解率分別為41.90%、45.35%和32.25%,其他菌株的降解率也高于20%。根據(jù)正交實驗設(shè)計得出,菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和 SF9且 添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2組成的高效菌群的降解效果優(yōu)于單個菌株的降解效果,降解效果高達57.88%。

    猜你喜歡
    桿菌屬稠油單胞菌
    相變換熱技術(shù)在油田稠油開采中應(yīng)用
    化工管理(2022年14期)2022-12-02 11:42:50
    潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群分布特征分析
    稠油不愁
    養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間生態(tài)位特性
    槲皮素改善大鼠銅綠假單胞菌肺感染
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:21
    持續(xù)性根尖周炎中牙齦卟啉單胞菌的分離與鑒定
    生化微生物技術(shù)在稠油采出水處理中的應(yīng)用
    遼河油田破解稠油高溫調(diào)剖難題
    銅綠假單胞菌金屬酶及整合酶的檢測
    類芽孢桿菌屬β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中可溶性重組表達的優(yōu)化
    欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品久久久av美女十八| 色综合站精品国产| 99精品久久久久人妻精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 男人操女人黄网站| 脱女人内裤的视频| 国产视频一区二区在线看| 99re在线观看精品视频| 国产高清有码在线观看视频 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久香蕉激情| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 激情视频va一区二区三区| av欧美777| 天天添夜夜摸| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看舔阴道视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美丝袜亚洲另类 | 夜夜爽天天搞| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美精品亚洲一区二区| 免费少妇av软件| 国产精品av久久久久免费| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产区一区二久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 极品教师在线免费播放| 热99re8久久精品国产| 窝窝影院91人妻| 老汉色∧v一级毛片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黄片播放在线免费| 一区二区三区激情视频| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲午夜理论影院| 啦啦啦免费观看视频1| 91av网站免费观看| 精品国产一区二区久久| 国产免费男女视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 大型av网站在线播放| 国产成人欧美在线观看| 国产免费男女视频| 在线永久观看黄色视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 天堂影院成人在线观看| 欧美成人午夜精品| 在线天堂中文资源库| 波多野结衣一区麻豆| 怎么达到女性高潮| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成在线人永久免费视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 女警被强在线播放| 在线播放国产精品三级| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩精品中文字幕看吧| 国产视频一区二区在线看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产高清激情床上av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品国产一区二区久久| 国产成人免费无遮挡视频| 不卡一级毛片| 国产xxxxx性猛交| 免费高清视频大片| 欧美日韩乱码在线| 大香蕉久久成人网| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲全国av大片| 91成人精品电影| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产精品日韩av在线免费观看 | 在线观看免费视频日本深夜| 久久久国产精品麻豆| aaaaa片日本免费| 欧美日本视频| 国产高清激情床上av| 日韩大码丰满熟妇| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 大型黄色视频在线免费观看| 91av网站免费观看| 91大片在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产三级黄色录像| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲av五月六月丁香网| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲欧美激情在线| 露出奶头的视频| 两人在一起打扑克的视频| 99国产精品一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品成人免费网站| 91老司机精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 99国产精品一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 成年人黄色毛片网站| 黄色毛片三级朝国网站| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 日本黄色视频三级网站网址| www.999成人在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲,欧美精品.| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费观看精品视频网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美成狂野欧美在线观看| 一级毛片精品| 在线观看一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 91精品国产国语对白视频| 午夜福利高清视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产1区2区3区精品| 久久人人精品亚洲av| 男女下面插进去视频免费观看| 日本在线视频免费播放| 日韩精品青青久久久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产色视频综合| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99riav亚洲国产免费| 脱女人内裤的视频| 亚洲片人在线观看| 午夜精品在线福利| 无限看片的www在线观看| 日本 av在线| www.www免费av| 怎么达到女性高潮| 国产xxxxx性猛交| 18美女黄网站色大片免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 看黄色毛片网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美日韩精品网址| 久久久久久国产a免费观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲无线在线观看| av天堂久久9| 成人av一区二区三区在线看| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久影院123| 999久久久国产精品视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 老司机在亚洲福利影院| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美亚洲日本最大视频资源| а√天堂www在线а√下载| 天堂影院成人在线观看| 国产三级在线视频| 高清毛片免费观看视频网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久亚洲精品不卡| 一区在线观看完整版| 成人永久免费在线观看视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产成人欧美在线观看| 999精品在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 女同久久另类99精品国产91| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 男人舔女人的私密视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 一级a爱片免费观看的视频| 久久精品成人免费网站| 热re99久久国产66热| 99re在线观看精品视频| 99久久国产精品久久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美日韩乱码在线| 怎么达到女性高潮| 午夜免费观看网址| 色综合欧美亚洲国产小说| 妹子高潮喷水视频| cao死你这个sao货| 男男h啪啪无遮挡| 在线观看免费视频网站a站| 午夜精品久久久久久毛片777| 无限看片的www在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 麻豆成人av在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 老司机福利观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 久久久久精品国产欧美久久久| 91字幕亚洲| av视频在线观看入口| 亚洲男人的天堂狠狠| 又黄又粗又硬又大视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久热这里只有精品99| 免费搜索国产男女视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 国产1区2区3区精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 天堂√8在线中文| 亚洲欧美精品综合久久99| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品影院久久| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 一本综合久久免费| 黄色视频不卡| 久久国产精品人妻蜜桃| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产高清视频在线播放一区| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 久久 成人 亚洲| 国产精品1区2区在线观看.| 国产又爽黄色视频| 久久精品91无色码中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产又爽黄色视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 国产三级黄色录像| 国内精品久久久久精免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| av福利片在线| 成人国产综合亚洲| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国语自产精品视频在线第100页| 此物有八面人人有两片| 亚洲性夜色夜夜综合| bbb黄色大片| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | av有码第一页| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩欧美在线二视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美色视频一区免费| 日韩精品中文字幕看吧| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文字幕久久专区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 午夜成年电影在线免费观看| av欧美777| 桃色一区二区三区在线观看| 嫩草影视91久久| 久久九九热精品免费| 9热在线视频观看99| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美午夜高清在线| 国产高清videossex| 一级a爱片免费观看的视频| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 手机成人av网站| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美大码av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久国内视频| 亚洲专区国产一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品乱码久久久久久99久播| www.精华液| 久久久国产欧美日韩av| 最新在线观看一区二区三区| 乱人伦中国视频| 99精品久久久久人妻精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 母亲3免费完整高清在线观看| 窝窝影院91人妻| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产激情久久老熟女| 波多野结衣av一区二区av| 精品无人区乱码1区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精华一区二区三区| 久久香蕉精品热| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 热re99久久国产66热| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品日产1卡2卡| 午夜福利18| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 18禁观看日本| 精品无人区乱码1区二区| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久国内视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中亚洲国语对白在线视频| 女性被躁到高潮视频| 制服丝袜大香蕉在线| 成人精品一区二区免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产亚洲av高清不卡| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av五月六月丁香网| 色播亚洲综合网| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 天天一区二区日本电影三级 | 妹子高潮喷水视频| 亚洲成av人片免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线观看66精品国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产精品影院久久| 国产麻豆成人av免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一本久久中文字幕| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 大香蕉久久成人网| 国产午夜福利久久久久久| 午夜免费激情av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 在线观看免费日韩欧美大片| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩一级在线毛片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品熟女少妇八av免费久了| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 很黄的视频免费| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品熟女少妇八av免费久了| 91字幕亚洲| 午夜老司机福利片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产国语露脸激情在线看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 日本三级黄在线观看| 亚洲片人在线观看| 精品第一国产精品| 久久精品影院6| 窝窝影院91人妻| 久久久久久国产a免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜亚洲福利在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品 国内视频| 麻豆成人av在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲五月色婷婷综合| 一本久久中文字幕| 一区二区三区高清视频在线| 久久这里只有精品19| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色av中文字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品美女久久av网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 淫秽高清视频在线观看| 国产免费男女视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲熟女毛片儿| 欧美成狂野欧美在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 91麻豆av在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 国产精品一区二区三区四区久久 | 午夜激情av网站| 免费看十八禁软件| 一区二区三区高清视频在线| aaaaa片日本免费| 色在线成人网| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久精品国产清高在天天线| 丁香六月欧美| 叶爱在线成人免费视频播放| 不卡av一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 丝袜在线中文字幕| 久久精品成人免费网站| 悠悠久久av| 人人妻人人澡人人看| 乱人伦中国视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 我的亚洲天堂| or卡值多少钱| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲黑人精品在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 热99re8久久精品国产| 久久国产乱子伦精品免费另类| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久亚洲精品不卡| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久久久久久午夜电影| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产亚洲精品久久久久5区| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲人成电影观看| 男人舔女人的私密视频| 狂野欧美激情性xxxx| avwww免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 咕卡用的链子| 午夜福利在线观看吧| 999精品在线视频| 无人区码免费观看不卡| 丁香欧美五月| av天堂久久9| 国产三级黄色录像| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一边摸一边抽搐一进一小说| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 男人舔女人下体高潮全视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久国产精品麻豆| 无限看片的www在线观看| 夜夜爽天天搞| 少妇粗大呻吟视频| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品久久久久久精品电影 | 久久久久久人人人人人| 桃色一区二区三区在线观看| 国产高清激情床上av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美中文日本在线观看视频| 久久亚洲精品不卡| 怎么达到女性高潮| 午夜亚洲福利在线播放| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 青草久久国产| 国产精品影院久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av电影中文网址| 久久精品成人免费网站| 亚洲 国产 在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 一进一出好大好爽视频| 男男h啪啪无遮挡| 色播亚洲综合网| 黄色 视频免费看| 欧美黄色淫秽网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美性长视频在线观看| 午夜精品在线福利| 丁香欧美五月| 高潮久久久久久久久久久不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品一区二区三区av网在线观看| 极品教师在线免费播放| 欧美成人午夜精品| 亚洲免费av在线视频| 国产av一区二区精品久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 大型av网站在线播放| 国产成人欧美| 99久久综合精品五月天人人| 黄片小视频在线播放| 黑人操中国人逼视频| 免费搜索国产男女视频| 亚洲专区中文字幕在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲精品美女久久av网站| www日本在线高清视频| 后天国语完整版免费观看| 成人三级黄色视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日韩视频一区二区在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 很黄的视频免费| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜日韩欧美国产| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 校园春色视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 激情在线观看视频在线高清| 一级作爱视频免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 级片在线观看| 嫩草影院精品99| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久这里只有精品19| 婷婷六月久久综合丁香| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产成人欧美| 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线天堂中文资源库| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 三级毛片av免费| 在线永久观看黄色视频| 国产亚洲精品一区二区www| 桃红色精品国产亚洲av| 国产在线观看jvid| 国产精品电影一区二区三区| 日本 欧美在线| 波多野结衣高清无吗| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲av美国av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久 成人 亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | av超薄肉色丝袜交足视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| av天堂久久9| 一夜夜www| 久久久久久人人人人人| 黄色丝袜av网址大全| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲专区字幕在线| av福利片在线| 国产欧美日韩一区二区三| 又黄又粗又硬又大视频| av福利片在线| 亚洲激情在线av| 国产成+人综合+亚洲专区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品人妻在线不人妻| 成人永久免费在线观看视频| 69精品国产乱码久久久| 国产主播在线观看一区二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男人操女人黄网站| 婷婷六月久久综合丁香| 美国免费a级毛片| 两性夫妻黄色片| 在线观看免费视频网站a站| 91九色精品人成在线观看| 国产av又大| 午夜a级毛片| av电影中文网址| av福利片在线| 国产精品,欧美在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | av有码第一页| 亚洲成人免费电影在线观看| 成人亚洲精品av一区二区|