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    高效原油污染降解菌的篩選、鑒定及菌群的構(gòu)建

    2021-05-14 06:01:28朱淑芳EHENEDENIyobosa寧海軍尚潔昊李武陽孟憲剛
    生物技術(shù)通報 2021年4期
    關(guān)鍵詞:桿菌屬稠油單胞菌

    朱淑芳 EHENEDEN Iyobosa 寧海軍 尚潔昊 李武陽 孟憲剛

    (蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,蘭州 730070)

    石油是地下巖石中生成的、液態(tài)的、以碳氫化合物為主要成分的可燃性礦產(chǎn),且直接從油井中開采出來未加工的石油稱為原油[1]。原油按組成分類分為蠟基原油、環(huán)烷基原油和中間基原油3類。石蠟基原油中烷烴較多;環(huán)烷基原油含環(huán)烷烴、芳香烴較多;中間基原油介于二者之間[2];根據(jù)相對密度分為重質(zhì)原油(d420,0.9-1.0)和低質(zhì)原油(d420,0.77-0.85),重質(zhì)原油也稱為稠油,稠油與普通原油相比,膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的含量較高[3]。由于原油中含有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴、含硫化合物等,其芳香烴中一些苯系物(甲苯、乙苯和二甲苯)揮發(fā)性大,在原油的加工、運輸、儲存過程中容易釋放到環(huán)境中,會對人體的血液、神經(jīng)系統(tǒng)具有較強危害[4]。硫化物是形成酸雨的主要原因,SO2有刺激性氣味,人吸入后會導(dǎo)致肺水腫甚至死亡[5]。

    石油在開采、加工、運輸過程中難免會產(chǎn)生石油污染物,石油污染已經(jīng)成為我國突出的環(huán)境問題之一[6-7]。目前,工業(yè)上大多數(shù)都是用物理化學(xué)法處理原油污染物,而物理化學(xué)法處理成本高,存在二次污染。所以,以原油為唯一碳源,利用微生物降解原油污染物成了研究的熱點。據(jù)研究報道,降解石油烴的微生物有200多種,其中,細菌對原油的降解能力優(yōu)于真菌和放線菌[8]。常見原油降解菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、產(chǎn)堿桿菌屬等(Alcaligenes)[9-10]。但這些菌株大都針對部分石油烴成分或者是輕質(zhì)原油,對于高黏度、高密度稠油的降解效果不是很顯著。例如,宋永亭等[11]從油田采出水篩選得到一株枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis sp.)S,在37℃、120 r/min對稠油處理14 d后,該菌株對瀝青質(zhì)降解率達34.87%。賈群超等[12]從石化廠周圍的油泥中分離到兩株不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)GS02和 GS07,將 1 g/L的稠油處理5 d后,降解率分別為45.3%和46.1%。任妍君等[13]用從稠油污染土壤中分離得到一株彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)DL1-G對稠油處理9 d后,該菌株對稠油的降解率39.89%。因此,篩選得到潛在的高效原油菌株對原油污染物的處理是至關(guān)重要的。本實驗以山東原油污染污泥為研究對象,從實驗室自有菌株及從污染源中分離出原油降解菌株,通過原油降解試驗檢測菌株對原油的降解能力,旨在篩選出原油高效降解菌株,并通過正交實驗得到原油降解高效菌群,旨為石油污染物的生物法治理提供優(yōu)秀的的烴降解菌株資源。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗材料 山東某油田的含油污泥、實驗室自有菌種、山東某油田污染土壤。

    1.1.2 試劑 牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);蛋白胨(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);氯化鈉(廣東光華科技股份有限公司);七水合硫酸鎂(廣東光華科技股份有限公司);七水合硫酸亞鐵(天津市蘇莊化學(xué)試劑廠);磷酸二氫鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠);硝酸銨(萊陽化工試驗廠);三氯化鐵(煙臺市雙雙化工有限公司);硫酸銨(天津市北辰方正試劑廠);硝酸鈉(天津市百世化工有限公司);一水合磷酸二氫鈉(天津市北辰方正試劑廠);硫酸銅(天津市化工三廠有限公司);氯化鈣(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

    1.1.3 儀器 SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);SPX型智能生化培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司);TGL-16G離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9012)(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);電子天平(FA2004N)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);雙功能水浴恒溫振蕩器(常州天瑞儀器有限公司)。

    1.1.4 培養(yǎng)基 NA液體培養(yǎng)基[14]:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.8-7.2,121℃滅菌20 min。NA固體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.8-7.2,121℃滅菌 20 min。SY 培養(yǎng)基[15]:初 篩 KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NH4NO31 g,CaCl20.02 g,F(xiàn)eCl3痕量,原油2 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2-7.4,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。GJ培養(yǎng)基[15]:用于石油降解(NH4)2SO40.5g,NaNO30.5 g,KH2PO41 g,NaH2PO4·H2O 1 g,微量元素液 2 mL,pH 7.0,原油2 g,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。微量元素液:ZnSO40.1%,CaCl20.1%,CuSO40.15%,MgSO4·7H2O 0.4%,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15%。

    1.2 方法

    1.2.1 菌源的制備及富集培養(yǎng) 參考文獻[15]中的方法,取10 g油泥溶于90 mL的無菌水中,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖4 h后,靜置沉淀2 h,以上清液作為菌源,取2 mL上清液加入富集培養(yǎng)基中,以轉(zhuǎn)速150 r/min,30℃恒溫培養(yǎng)136 h,再吸取5 mL渾濁培養(yǎng)液加入到新鮮的SY培養(yǎng)基中,按上述條件連續(xù)培養(yǎng)3-4次,實現(xiàn)降解石油烴菌的富集。

    1.2.2 高效菌株的分離純化 將上述1.2.1中制得的菌懸液取5 mL接種于GJ培養(yǎng)基中,在30℃,150 r/min的培養(yǎng)條件下,用恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至GJ培養(yǎng)基渾濁,吸取1 mL做梯度稀釋涂布接種于石油平板上,30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d,在NA培養(yǎng)基中反復(fù)劃線純化后得到單一菌落。

    1.2.3 高效菌株的定性篩選 用2,6-二氯酚靛酚(2,6-dichlorophenol indophenol,DCPIP)方法[16-17]篩選石油降解菌株,純化后的菌株用初始發(fā)酵培養(yǎng)基(150 r/min、30℃)發(fā)酵培養(yǎng)48 h,10 000 r/min離心15 min,然后用0.85% NaCl 溶液洗滌兩次,調(diào)整其OD600為1。取一離心管并在其中加入200 μL GJ培養(yǎng)基(未添加石油)、30 μL 石油、20 mg/L DCPIP 作為氧化還原指示劑,加30 μL 經(jīng)上述處理的菌液后,在30℃下培養(yǎng)72 h,通過DCPIP顏色的變化作為衡量菌株降解石油的能力標準。每株菌株做3組平行樣。

    1.2.4 高效菌株的16S rRNA基因序列的擴增及測定 將分離篩選的菌株分別接種于NA液體培養(yǎng)基中,30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期或穩(wěn)定期,菌液渾濁。每個菌株分別取2 mL 菌液于離心管中,12 000 r/min 離心2 min,棄上清液留菌體,向離心管中加入500 μL無菌雙蒸水,渦旋30 s,置95℃水浴 5 min,12 000 r/min離心2 min。以上清液作為模板[18]。

    采用細菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R :5′-TACGACTTAACCCCAATCGC -3′對分離得到的菌株進行PCR擴增。反應(yīng)體系(25 μL):PCR MIX 12.5 μL,上下游引物各 0.5 μL,ddH2O 10.5 μL,模板 1 μL,擴增程序為 :95℃預(yù)變性5 min,進入PCR循環(huán),94℃變性45 s,54℃退火 1.5 min,72℃延伸 10 min[19]。

    1.2.5 高效菌株的定量篩選 將從1.2.4中篩選得到的菌株在NA培養(yǎng)基中進行活化,使菌液的OD600值為1,吸取8 mL菌液接種到含油量為0.25%的GJ培養(yǎng)基中,150 r/min、30℃下培養(yǎng)7 d后用重量法檢測石油的降解率,每組試驗3個平行,取平均值。

    1.2.6 重量法檢測原油的降解率 參照 Gao等[20]的方法用重量法測定菌株對石油的降解率,用三氯甲烷萃取1.2.5中培養(yǎng)7 d后的處理液,在每個處理試樣中加入30 mL三氯甲烷,全部移入分液漏斗后充分搖勻,并靜置,待完全分層后,收集下相,再用三氯甲烷萃取3-4次,合并下相,并用無水Na2SO4脫水干燥,放入烘箱中60℃烘干冷卻后稱重,以不加菌株的處理為空白對照,計算降解率,每組試驗3個平行,取平均值。

    降解率 =[(m0-m1)÷m0]×100%

    m0:對照組的殘油重量(g);m1:降解后樣品的殘油重量(g)。

    1.2.7 高效菌群的構(gòu)建 采用九因素三水平的方式通過正交實驗進行菌群構(gòu)建。將9種菌設(shè)為9種因素,每種菌設(shè)置3個接種量(0、0.5、1)作為三水平。將各個菌株分別接入NA液體培養(yǎng)基,直至OD600為1。稱取0.2 g固體原油,放入裝有80 mL GJ培養(yǎng)基的150 mL三角燒瓶,121℃高溫殺菌20 min。將各個菌體按照構(gòu)建組合和比例分別接入培養(yǎng)基中,各個構(gòu)建和組合均做3組平行。在30℃,150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中降解7 d,測定原油降解率。選出最佳降解菌群。

    2 結(jié)果

    2.1 高效菌株的分離純化

    對所采集的樣品經(jīng)過富集培養(yǎng)以及初篩,分離純化得到9株微生物,分別編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7、SF8和 SF9, 且 發(fā) 現(xiàn) 菌 株SF1、SF2、SF7、和SF9的菌株生長較快,菌落形態(tài)較大,如圖1所示。

    2.2 DCPIP篩選高效菌株

    用DCPIP對上述分離的9株微生物進行顯色篩選。由圖2可知,所有菌株在經(jīng)過不同的時間后,DCPIP由藍色完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色,說明這9株菌株對石油有較強的降解能力,在圖2-A中,菌株SF3、SF7、SF8在24 h后由藍色變?yōu)闊o色,在圖2-B中菌株SF1、SF2、SF9在48 h后由藍色變?yōu)闊o色,而圖2-C中而菌株SF4、SF5、SF6在72 h后藍色變?yōu)闊o色,在未添加微生物的離心管,DCPIP未變色。Varjani Sunita等用該方法從石油污染的土壤和水中分離出6株石油降解菌株,最短120 h內(nèi)可使DCPIP由藍色變?yōu)闊o色。這是因為石油、多環(huán)芳烴以及烷烴等碳氫化合物的降解氧化情況可用氧化還原指示劑DCPIP 進行評估,其主要功能在于可靈敏地反應(yīng)碳氫化合物初步氧化過程。通常 DCPIP 在氧化態(tài)時呈深藍色,將其添加至微生物降解石油的培養(yǎng)基中,其作為電子受體接受碳氫化合物氧化時所產(chǎn)生的電子從而變?yōu)闊o色。

    圖1 原油降解菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of crude oil-degrading strains

    圖2 DCPIP定性篩選原油降解菌株Fig.2 Qualitative screening of crude oil-degrading strains by DCPIP

    2.3 高效菌株的序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    對分離篩選得到的9株微生物進行DNA的提取,并進行PCR擴增且測序,序列經(jīng)NCBI中的blast比對分析,篩選菌株與相似菌株的同源性都高達95%以上,鑒定 SF1為中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium),SF2 為腸桿菌(Enterobacter sp.),SF3為不動桿菌(Acinetobacter sp.),SF4為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),SF5為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri),SF6假單胞菌(Pseudomonas sp.),SF7為 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌(Acinetobacter calcoaceticuspartial sequence),SF8為 霍 氏 腸 桿 菌(Enterobacter hormaecheipartial sequence),SF9 為松嫩平原假單胞菌(Pseudomonas songnenensis)。并將這些菌株基于16S rRNA序列的進化樹分析。由圖3所示,系統(tǒng)發(fā)育樹自展值均大于85%,證明該系統(tǒng)發(fā)育樹可信度高。

    2.4 原油降解試驗及降解率的測定

    將9株微生物的發(fā)酵液,按10%的接種量接入以石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中,進行搖瓶降解試驗,7 d后,結(jié)果如圖4所示:與對照相比,添加微生物的油膜消失,并將原油分解成小油滴,且原油的貼壁力有不同程度的下降,說明此微生物能利用原油為碳源作為營養(yǎng)物質(zhì),將大分子原油降解成小分子,或分解成二氧化碳和水。從圖5可知,菌株中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)SF1降解能力最強,降解率達48.73%,菌株腸桿菌(Enterobacter sp.)SF2、醋酸鈣不動桿菌SF7(Acinetobacter calcoaceticus)、松嫩平原假單胞菌SF9(Pseudomonas songnenensis)的降解能力略低于菌株SF1,降解率分別為41.90%、45.35%、32.25%,其他菌株的降解率也高于20%。

    2.5 高效菌群的構(gòu)建

    由正交實驗設(shè)計,得到了27種菌群組合。通過不同混合菌群對原油的降解試驗效果可以得出,有的混合菌群的降解效果優(yōu)于單個菌株的降解效果。這可能是因為菌株之間存在一定的協(xié)同作用,促進降解石油烴相關(guān)酶的活性,而也有混合菌群的降解能力低于單個菌株的降解效果,這可能是菌株之間的競爭抑制作用造成的。由表1可以得到菌株間的最佳組合形式以及菌株之間的添加比例,從實驗結(jié)果可以看出組合9的降解效果最好,對原油的降解率高達57.88%,最低的降解效率是組合18也就是空白實驗,原油降解效率為2.50%。組合9是為最佳高效菌群,由菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2 組成。

    圖3 原油降解菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of crude oil-degrading strain

    圖4 搖瓶發(fā)酵降解原油試驗Fig.4 Crude oil degradation experiment by shaking flask fermentation

    3 討論

    圖5 不同菌株對原油的降解率Fig.5 Degradation rate of crude oil by different strains

    目前,國內(nèi)外研究學(xué)者已獲得原油降解菌株有100多個屬,200個種[21]。本研究獲得的不動桿菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬是常見的原油降解菌株[22],并且大量研究表明不動桿菌屬和假單胞菌屬、腸桿菌屬對輕質(zhì)原油具有很好的降解效果[23-25]。不動桿菌屬細菌對石油烴中烷烴的降解效果最好,降解烷烴一般通過脂肪酸 β氧化[26];而假單胞菌屬細菌則對芳香烴的降解效率較高[27],國內(nèi)外對腸桿菌屬在降解原油機理方面的報道相對較少。藍慧等[28]分離的腸桿菌屬在pH 8.91、NaCl 濃度為1.19%、溫度為36.78℃以200 r/min的條件下對含油量為1%的培養(yǎng)基振蕩處理7 d后,對原油的降解率34.60%,而本文篩選的腸桿菌屬對原油的降解率高達41.90%,優(yōu)于藍慧等分離的腸桿菌屬,可能是由于pH和含氧量的不同直接影響到了微生物的生長,從而間接的影響到石油烴的降解;溫度的改變可以使石油污染物的黏度和溶解性發(fā)生變化,也能影響到微生物的生長狀況和其體內(nèi)的酶活性,從而影響石油的整個降解過程。周婷等[29]分離的不動桿菌屬在30℃、150 r/min的條件下對4 g/L的原油培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后,該菌株對原油的降解率達42.15%,與本研究篩選的不動桿菌屬相比,本研究篩選的不動桿菌更有利于原油的降解,因為本研究在30℃、150 r/min的條件下,處理7 d后,對原油的降解率高達45.35%,因此本研究篩選的不動桿菌更有利于原油的降解。中間蒼白桿菌屬對原油的降解報道不是很常見,尤其對相對密度大的原油降解報道罕見。高鵬飛等[30]從煉油廢水中篩選出的一株高效降解石油烴菌株蒼白桿菌(Ochrobactrum ciceri),該菌株對含柴油濃度為4 000 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基在120 r/min、30℃下振蕩處理6 d后,結(jié)果顯示,石油烴降解率高達98.98%。本實驗分離的蒼白桿菌屬SF1在2.5 g/L的原油培養(yǎng)基中7 d后,對原油的降解率為48.37%。從降解率看高鵬飛等篩選的蒼白桿菌屬對原油的降解效果優(yōu)于本實驗篩選得到的蒼白桿菌屬,但柴油屬于輕質(zhì)原油,黏度比稠油小,更易于微生物的降解。

    表1 高效菌群對原油的降解率Table 1 Degradation rate of high-efficiency bacteria on crude oil

    自然環(huán)境中的微生物多種多樣,石油的降解是一個極為復(fù)雜的過程,單個菌株很難實現(xiàn)原油組分的全部降解,構(gòu)建高效菌群可以結(jié)合各單個菌株的降解能力而形成一個較完整的降解體系,發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用,實現(xiàn)對原油的高效降解[31-32]。本研究通過正交實驗設(shè)計得到最佳高效菌群的構(gòu)建,結(jié)果 表 明, 菌 株 SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2組成的菌群對原油的降解效果優(yōu)于單個菌株,降解率達57.88%。而王海峰等[33]將分離得到的16株稠油降解菌株(紅球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等)進行等比列混合,對含油量1 000 mg/L的培養(yǎng)基處理7 d,結(jié)果顯示,該混合菌群對稠油的降解率為68%,該菌群對原油的降解效果優(yōu)于本研究構(gòu)建的高效菌群。可能是因為菌株的種類、比列及含油量的不同導(dǎo)致的,若含油量過高,使C∶N∶P值失衡,造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,影響菌株的生長,進而影響對原油的降解;也有可能原油濃度過大時,阻隔了菌體與氧氣的接觸,導(dǎo)致菌體不能良好的生長,從而使降解率下降。

    4 結(jié)論

    本研究從原油污泥、實驗室自有菌株以及原油污染的土壤中分離篩選出9株微生物,分別為SF1中間蒼白桿菌屬(Ochrobactrum intermedium),SF2、SF8屬于腸桿菌屬(Enterobacter sp.),SF3、SF7為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.),SF4、SF5、SF6、SF9屬于假單胞菌菌屬(Pseudomonas sp.)。通過對2.5 g/L的原油進行搖瓶實驗發(fā)現(xiàn),蒼白桿菌 屬(Ochrobactrum intermedium)SF1降 解 能 力最強,降解率達48.73%,腸桿菌屬(Enterobacter sp.)SF2、 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌 SF7(Acinetobacter calcoaceticus)、松嫩平原假單胞菌SF9(Pseudomonas songnenensis)的降解能力略低于菌株SF1,降解率分別為41.90%、45.35%和32.25%,其他菌株的降解率也高于20%。根據(jù)正交實驗設(shè)計得出,菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和 SF9且 添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2組成的高效菌群的降解效果優(yōu)于單個菌株的降解效果,降解效果高達57.88%。

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