益腎降濁沖劑對(duì)5/6 腎切除模型大鼠腎纖維化及NF－κB 和TGF－β1/Smad3 信號(hào)通路的影響

鄭敏麟，傘 勤，劉 廣

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是一種常見的進(jìn)行性疾病，同時(shí)也是世界上死亡率和發(fā)病率最高的疾病之一［1］。其中腎臟纖維化是CKD 的主要病理改變［2］，同時(shí)也是造成CKD 患者死亡的重要原因之一［3］。慢性腎臟病能夠活化間質(zhì)成纖維細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha－smooth muscle actin，α－SMA）陽性的肌成纖維細(xì)胞，這些間質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞的積累和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積會(huì)引起腎間質(zhì)纖維化［4－6］。而上述腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化過程，被認(rèn)為是由生長(zhǎng)因子和炎性細(xì)胞因子逐漸增加所介導(dǎo)的［7］?，F(xiàn)已有許多研究證實(shí)了核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著其重要的作用，而除了NF-κB 之外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）也被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著其獨(dú)特的作用，TGF-β1可能通過Smad 信號(hào)通路發(fā)揮其作用。一些細(xì)胞因子通過激活TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路，刺激膠原蛋白基質(zhì)沉積并促進(jìn)腎小管間質(zhì)和腎小球纖維化［8-9］。前期研究已經(jīng)證實(shí)，益腎降濁沖劑能夠改善5/6 腎切除大鼠的腎臟功能，延緩慢性腎衰的進(jìn)展，且有研究表明，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1與Smad3信號(hào)通路相關(guān)［10-11］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究擬從NF-κB 與TGF-β1/Smad3 雙信號(hào)通路角度進(jìn)一步探討益腎降濁沖劑在慢性腎臟病中的抗纖維化作用，為慢性腎臟病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠72 只，雌雄各半，6 周齡，重量（180～220）g，購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號(hào)：20170005005915。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±2）%，自由攝食飲水。

1.1.2 藥物與試劑 益腎降濁沖劑由生黃芪30 g，太子參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，玉竹15 g，當(dāng)歸15 g，桑椹15 g，桑寄生15 g，懷牛膝15 g，丹參15 g，山楂15 g，陳皮15 g，大黃15 g，六月雪15 g，車前子15 g 組成，由福建省第三人民醫(yī)院中藥房提供。大黃素（索萊寶科技有限公司，批號(hào)：IE0070）。肌酐測(cè)定試劑盒、尿素氮測(cè)定試劑盒（長(zhǎng)春匯力，批號(hào)分別為：A015、B006），Masson 三色染色試劑盒（索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1340），白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海西唐，批號(hào)分別為：F15810、F15871、F16960），NF-κB、TGF-β1、Smad3 抗體（Abcam 公司，批號(hào)分別為：ab16502，ab215715，ab40854），免疫組化試劑盒（凱基生物，批號(hào)：KGOS60）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：Anke，TDL80-2B），酶標(biāo)儀（美國特寶，型號(hào)：Epoch），石蠟切片機(jī)（德國萊卡，型號(hào)：RM2235），生物組織攤烤片機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：YT-7FB），倒置顯微鏡（日本尼康，型號(hào)：TS-100F）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 尿毒癥大鼠模型的建立 手術(shù)大鼠以20%烏拉坦麻醉，先切除左腎2/3 腎組織，后于1 周后切除整個(gè)右腎，兩次手術(shù)共切除腎臟約80%左右。假手術(shù)大鼠僅在背部做一切口，暴露腎臟后再縫合傷口。

1.2.2 分組及給藥 72 只大鼠隨機(jī)選取12 只進(jìn)行假手術(shù)，其余為60 只進(jìn)行手術(shù)，按以上方法制作尿毒癥大鼠模型。手術(shù)完成后，剔除手術(shù)失敗和死亡的大鼠，造模成功存活50 只大鼠，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組，大黃素組，益腎降濁沖劑低、中、高劑量組，另從12 只假手術(shù)大鼠中隨機(jī)選出10 只作為假手術(shù)組，然后根據(jù)大鼠劑量是人體6 倍的計(jì)算公式，計(jì)算出益腎降濁沖劑按照低、中、高劑量（9 g/kg，18 g/kg，36 g/kg）配成水煎劑，大黃素的劑量為500 mg/kg，藥液按1 mL/100 g灌胃量進(jìn)行灌胃，模型組和假手術(shù)組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)用藥8 周。

13 標(biāo)本收集與檢測(cè)方法

治療結(jié)束后進(jìn)行取材，取材前1 晚給予禁食處理，第2 天以20%烏拉坦經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉完成后，取腹主動(dòng)脈血用于ELISA 及生化檢測(cè)。取血完成后取腎臟，取出腎臟后，用生理鹽水沖洗除去血污及脂肪等組織，放入4%多聚甲醛中用于石蠟包埋。

1.3.1 各組大鼠血清BUN、SCR 含量檢測(cè) 將取出的腹主動(dòng)脈血室溫靜置2 h 以后，將腹主動(dòng)脈血離心，得到血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量測(cè)定 分別采用大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒檢測(cè)外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，并參照該試劑盒說明書操作。

1.3.3 腎臟組織Masson 染色 取石蠟塊，切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，Weigert 鐵蘇木素染色液染色5 min，酸性乙醇分化液分化10 s，Masson 藍(lán)化液返藍(lán)10 min，蒸餾水洗1 min，麗春紅品紅染色液染色3 min，磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min，直接放入苯胺藍(lán)染色液中染色50 s，弱酸工作液洗1 min，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，后觀察各組大鼠腎臟纖維化情況。

1.3.4 腎臟組織中NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白檢測(cè) 取腎臟組織，石蠟包埋，包埋后切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，脫水后，枸鹽酸微波修復(fù)20 min，恢復(fù)至室溫之后，滴加過氧化氫室溫孵育15 min，PBS 清洗3 次后，滴加5%羊血清，室溫孵育60 min，然后滴加一抗，4 ℃孵育過夜，第2 天將切片從冰箱中拿出，恢復(fù)至室溫后，PBS 清洗3 次，滴加2抗，孵育30 min 后，PBS 清洗3 次，隨后DAB 顯色，顯色后，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹脂封片。每組切片選取6 個(gè)視野，再采用Image-Pro Plus 6.0分析NF-κB、TGF-β1、Smad3 的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中BUN、SCR 含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組血清水平BUN、SCR明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素組，益腎降濁沖劑高、中、低劑量組大鼠血清BUN、SCR明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、SCR 含量比較 （±s）

表1 各組大鼠血清BUN、SCR 含量比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

?

2.2 各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組血清水平IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，大黃素組，益腎降濁沖劑高、中、低劑量組大鼠血清IL-1β 明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），益腎降濁沖劑高劑量組IL-6、TNF-α 含量明顯降低。結(jié)果見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織Masson 染色比較

Masson 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎組織只發(fā)現(xiàn)少量膠原纖維沉積。模型組大鼠的膠原纖維沉積明顯。益腎降濁沖劑各劑量組膠原沉積情況明顯改善。結(jié)果見圖1。

表2 各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量的比較（x ±）s

圖1 各組大鼠腎臟組織Masson 染色（400×）

2.4 各組大鼠腎臟組織NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟組織中NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比較，益腎降濁沖劑中、高劑量組大鼠腎臟組織中NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），益腎降濁沖劑低劑量組NF-κB 表達(dá)降低（P＜0.05），大黃素組TGF-β1 和Smad3 表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3，圖2～4。

表3 各組大鼠腎臟組織NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)情況 （x ±）s

圖2 各組大鼠腎臟組織中NF-κB 蛋白表達(dá)情況（400×）

3 討 論

腎纖維化在慢性腎臟病患者一種常見的病理改變，同時(shí)也是CKD 發(fā)展終末期腎功能衰竭的主要原因之一。腎纖維化主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白過度積聚、基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎功能損傷，最終引起慢性腎衰竭［11］。

眾所周知，炎癥反應(yīng)在慢性腎臟病腎病纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［13］，而NF-κB 信號(hào)通路被認(rèn)為是介導(dǎo)腎臟纖維化發(fā)展過程中腎臟炎癥的一條重要途徑［14］。當(dāng)NF-κB 信號(hào)通路被激活時(shí)，會(huì)釋放一系列的促炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，這些炎癥細(xì)胞因子通過刺激腎臟從而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而促使大量ECM 蛋白沉積在腎間質(zhì)，從而促進(jìn)腎纖維化形成［15］。孫響波等［16］研究表明，通過抑制NF-κB 信號(hào)通路能夠有效地抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到抑制腎纖維化的目的。

圖3 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1 蛋白表達(dá)情況（400×）

圖4 各組大鼠腎臟組織中Smad3 蛋白表達(dá)情況（400×）

近年來研究表明，除了NF-κB 信號(hào)通路外，TGF-β1也是造成慢性腎臟病腎纖維化的一條重要通路，TGF-β1能夠通過結(jié)合I 型和II 型TGF-β受體復(fù)合物刺激成纖維細(xì)胞的增殖和基質(zhì)積累，進(jìn)而激活TβRI 激酶，導(dǎo)致Smad2 和Smad3 磷酸化和激活。一旦被激活，Smad2 和Smad3 通過與Smad4 形成寡聚復(fù)合物而轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中［17］，從而誘導(dǎo)ECM 產(chǎn)生最終造成腎纖維化。陶鵬宇等［18］研究表明，當(dāng)TGF-β1/Samd3 信號(hào)通路被抑制時(shí)，腎臟纖維化情況能夠得到明顯改善。

中醫(yī)藥在我國有著廣泛用于慢性腎臟病治療的歷史，并被公認(rèn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的有效補(bǔ)充。在中醫(yī)文獻(xiàn)中并無關(guān)于腎臟纖維化的記載，但根據(jù)腎纖維化的形成和發(fā)展過程，可將其歸為中醫(yī)學(xué)中的“癥積”“水腫”“關(guān)格”等范疇。脾腎虧虛日久，導(dǎo)致濕毒外邪入侵，造成腎脈絡(luò)瘀阻，濕毒瘀在體內(nèi)相互交結(jié)，最終對(duì)腎臟造成損傷。而益腎降濁沖劑出自福建省名中醫(yī)阮詩瑋，具有健脾益氣、利濕泄?jié)峄龅墓π?，?duì)改善腎纖維化具有明顯輔助效果。本研究以5/6 腎切除誘導(dǎo)的慢性腎臟病大鼠模型為研究對(duì)象，觀察益腎降濁沖劑對(duì)慢性腎臟病大鼠腎纖維化的治療效果，結(jié)果顯示益腎降濁沖劑能夠延緩腎臟纖維化，降低血液中Scr、BUN，表明益腎降濁沖劑具有顯著的腎保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)明顯上升，而益腎降濁沖劑各劑量組大鼠血清中IL-1β 表達(dá)明顯下降，益腎降濁沖劑高劑量組IL-6、TNF-α 表達(dá)明顯下降，提示益腎降濁沖劑能夠降低炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，在此基礎(chǔ)上利用免疫組化法進(jìn)一步對(duì)各組大鼠的腎臟中NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示模型組腎臟組織中NFκB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)升高，而益腎降濁沖劑中、高劑量組NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)下降，表明益腎降濁沖劑能夠抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，減輕腎臟纖維化程度，改善腎功能，這可能與抑制NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白相關(guān)。

綜上所述，益腎降濁沖劑可抑制慢性腎臟病的腎纖維化、減輕機(jī)體炎癥損傷，其機(jī)制可能與抑制NF-κB、TGF-β1、Smad 信號(hào)通路有關(guān)。