取食不同寄主植物的灰飛虱對藥劑敏感性和解毒酶活性的影響

丁 杰，溫勝芳，王雪婷，薛燕楠，張國福，金 巖，夏曉明*

(1. 山東農業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271000；2. 山東省農藥檢定所，濟南 251000)

灰飛虱(small brown planthopper，SBPH)Laodelphaxstriatellus(Fallén)屬半翅目飛虱科，主要分布在亞洲和歐洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)，在我國長江流域和黃淮地區(qū)為害嚴重?；绎w虱世代周期短，1年可發(fā)生5～6代，各世代可在不同寄主間轉移危害，除取食水稻外，還可危害麥類、玉米等禾本科植物，同時田間禾本科雜草也可以為灰飛虱提供充足的營養(yǎng)條件(汪恩國，2007；喬慧等，2009)。灰飛虱除直接為害造成損失以外，主要傳播水稻條紋葉枯病(rice stripe virus, RSV)和黑條矮縮病(rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)等病毒病而造成水稻、小麥和玉米產量嚴重損失(Otukaetal.，2010；Zhangetal.，2010)。

由于寄主植物體內的次生物質對植食性昆蟲體內的解毒酶具有誘導作用(王沫等，2003)，同時不同寄主所含有的營養(yǎng)成分和次生代謝物質不同，所以當昆蟲取食不同寄主植物時，其體內的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和多功能氧化酶(MFO)等解毒酶活性會發(fā)生變化(呂朝軍等，2007；李曉磊和劉長明，2009；張睿等，2011；尹飛等，2013；Dermauwetal.，2018)。當昆蟲以不同寄主植物為食時，會影響昆蟲體內這些酶的活性以擴大寄主植物范圍(Wangetal.，2010)。除酶活外，昆蟲解毒酶基因的表達水平也受不同寄主植物的影響，且因寄主植物種類而異(Huangetal.，2018；Daietal.，2019)。害蟲體內參與植物次生物質代謝和對殺蟲劑起解毒作用的酶系是相同或相似的(姚洪渭等，2002；謝佳燕等，2007)，因此，寄主植物介導的解毒酶基因表達和解毒植物次生代謝物和化感物質所涉及的酶活性的變化可能影響昆蟲的適應性，并影響昆蟲對殺蟲劑的敏感性(Taoetal.，2012)。并在小菜蛾Plutellaxylostella(尹飛等，2013)、斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius(Xueetal.，2010；Karuppaiahetal.，2016)、B型煙粉虱BemisiatabaciGennadius(Castleetal.，2009；Xieetal.，2011)、朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus(戴宇婷，2013)等多種害蟲中得到證實。

為探索取食不同寄主植物對灰飛虱的影響，本研究選取了灰飛虱的常見寄主水稻(紫香糯2315和武育粳3號)、小麥(農大26和濟麥22)及稗草，將灰飛虱在這5種寄主上連續(xù)飼養(yǎng)3代后，測定了其對不同藥劑的敏感性以及常見解毒酶活性的變化。研究結果可為灰飛虱的抗性發(fā)展研究提供依據，并為灰飛虱的田間科學用藥和綜合治理策略的制定提供指導。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

灰飛虱種群2017年5月采集自山東省魚臺縣水稻良種繁育基地的小麥田，于RXZ智能型人工氣候培養(yǎng)箱中，在塑料盒(35 cm×25 cm×15 cm)中用未接觸農藥的紫香糯2315水稻飼養(yǎng)繁殖。水稻苗每10～15 d更換一次，以確?；绎w虱可以獲得充足的營養(yǎng)。試驗進行之前灰飛虱已在實驗室在不接觸藥劑的條件下飼養(yǎng)20代以上。飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃，相對濕度75%±5%，光周期L ∶D=16 h ∶8 h。

1.2 供試寄主植物

供試5種寄主植物包括2個水稻OryzasativaL.品種(紫香糯2315和武育粳3號)，由山東省水稻研究所提供；2個小麥TriticumaestivumL.品種(農大26和濟麥22)，由山東農業(yè)大學農學院提供；1種禾本科雜草：稗草EchinochloacrusgalliBeauv.，采自山東省魚臺縣水稻良種繁育基地。5種寄主植物均為灰飛虱的常見寄主。將灰飛虱分別轉接到供試的5種寄主植物上，按照1.1的飼養(yǎng)條件連續(xù)飼養(yǎng)3代后，選取3齡灰飛虱若蟲進行藥劑敏感性和解毒酶活性測定。

1.3 供試藥劑及試劑

94%溴氰蟲酰胺原藥(cyantraniliprole，上海杜邦農化有限公司)，96.4%吡蟲啉原藥(imidacloprid，山東濰坊潤豐化工股份有限公司)，96%噻蟲嗪原藥(thiamethoxam，山東濰坊潤豐化工股份有限公司)，10%三氟苯嘧啶懸浮劑(triflumezopyrim，美國杜邦公司)，丙酮(天津市大茂化學試劑廠)，α-乙酸萘酯(α-NA)(上海麥克林生化科技有限公司)，固藍RR鹽(上海麥克林生化科技有限公司)，對硝基苯甲醚(p-NA)(上海麥克林生化科技有限公司)，1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB)(上海麥克林生化科技有限公司)，還原型谷胱甘肽(GSH)(北京索萊寶科技有限公司)，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)(北京索萊寶科技有限公司)，NaH2PO4(天津市凱通化學試劑有限公司)，Na2HPO4(天津市凱通化學試劑有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)(Amresco公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)(BBI公司)，苯基硫脲(PTU)(北京精細化工廠)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)、全自動酶標儀 680 型(Bio-Rad 公司)、Neofuge 13 R高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司)。

1.4 生物測定

參照班蘭鳳等(2015)和張凱倫等(2020)報道的稻苗浸漬法。用丙酮(10%三氟苯嘧啶懸浮劑用去離子水稀釋)將供試藥劑溶解，配制成1×104mg/L的母液。根據預試驗結果，將上述母液用0.1%吐溫80依次稀釋成一系列濃度。將6日齡左右的水稻苗連根一起在系列濃度的藥液中浸10～15 s，取出瀝至無液體滴下，自然晾干后以濕脫脂棉包住根部放入透明的試管中。用吸蟲器將試蟲移入試管(2 cm×20 cm)中，每管15頭，每個濃度3個重復，共45頭，然后用紗布封口，以防濕度過大增加死亡率和灰飛虱逃逸。待試蟲全部爬上稻苗或試管壁后，剔除機械損傷的個體，并補足15頭。接蟲后把試管放入溫度27±1℃，光周期為16 h ∶8 h(光照 ∶黑暗)的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。處理3 d后，檢查死蟲數(shù)，以不含藥劑的處理做空白對照。

1.5 酶活測定

1.5.1酶液制備

取不同寄主上的3齡灰飛虱若蟲20頭，用1 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH7.6，含1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L PTU和20% 甘油)冰浴勻漿，于4℃，10 000 rpm條件下離心15 min，上清液即待測酶液。

1.5.2酯酶(esterases，ESTs)活力測定

參照Han等(1998)的方法，并略做修改。將20 mg固藍RR鹽和0.2 mL 100 mmol/L α-乙酸萘酯(α-NA)加入到10 mL 0.2 mol/L, pH6.0的磷酸緩沖液中，振蕩混勻，過濾得到底物和顯色劑的混合液。在96孔酶標板中每孔加入20 μL經0.1 mol/L pH7.6磷酸緩沖液稀釋10倍的酶液和200 μL底物和顯色劑的混合液。用酶標儀在波長450 nm下記錄光密度值，酶促反應在27℃下進行，每隔30 s記錄一次，反應15 min。

1.5.3谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferases，GSTs)活力測定

參照Kao等(1989)的方法。在96孔酶標板中每孔加入50 μL 0.6 mmol/L 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和100 μL 6 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)，最后加入100 μL酶液。用酶標儀在波長340 nm下記錄光密度值，酶促反應在27℃下進行，每隔20 s記錄一次，反應15 min。

1.5.4多功能氧化酶(mixed-function oxidase，MFO)活力測定

參考Shang and Soderlund(1984)的方法。在96孔酶標板中每孔加入50 μL 1.0 mmol/L 對硝基苯甲醚(p-NA)和50 μL 1.0 mmol/L還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，最后加入100 μL酶液。用酶標儀在波長405 nm下記錄光密度值，酶促反應在27℃下進行，每隔20 s記錄一次，反應15 min。

1.5.4蛋白質含量的測定

使用BCA蛋白濃度測定試劑盒制作標準曲線，根據標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

1.6 數(shù)據處理

使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算出供試藥劑對不同寄主上的灰飛虱的毒力回歸方程式、LC50值及其95%置信限、b值及其標準誤，并采用Tukey’s test比較不同寄主植物上灰飛虱的解毒酶活性差異。

2 結果與分析

2.1 取食不同寄主植物灰飛虱對藥劑敏感性的影響

采用稻苗浸漬法，測定取食不同寄主植物的灰飛虱3齡若蟲對三氟苯嘧啶、吡蟲啉、噻蟲嗪和溴氰蟲酰胺的敏感性，結果見表1。從表1可以看出，連續(xù)取食不同寄主植物3代后，灰飛虱3齡若蟲對三氟苯嘧啶的敏感性無差異，但對吡蟲啉、噻蟲嗪和溴氰蟲酰胺的敏感性存在一定差異。其中，取食2個品種小麥的灰飛虱對吡蟲啉和溴氰蟲酰胺最敏感，取食2個水稻品種和稗草的灰飛虱對吡蟲啉和溴氰蟲酰胺敏感性相對較低。取食水稻武育粳3號的灰飛虱對噻蟲嗪最敏感；取食2個品種小麥的灰飛虱對噻蟲嗪相對較敏感，取食稗草和水稻紫香糯2315的灰飛虱對噻蟲嗪敏感性最低。

表1 取食不同寄主的灰飛虱對4種殺蟲劑的敏感性

2.2 取食不同寄主植物灰飛虱的解毒酶活性比較

連續(xù)取食不同寄主植物3代后，灰飛虱3齡若蟲體內的3種解毒酶活性存在明顯差異(表2)。取食稗草的灰飛虱解毒酶活性要明顯高于取食小麥的灰飛虱解毒酶活性。其中，取食稗草的MFO和ESTs活性均最高，取食2個品種小麥的MFO和ESTs活性均最低；取食2個品種小麥的ESTs活性差異顯著，但MFO活性沒有差異，取食2個品種水稻的MFO和ETSs活性差異顯著(P<0.05)。GST活性從大到小依次為紫香糯2315>稗草>濟麥22>武育粳3號>農大26，不同寄主之間差異顯著(P<0.05)。

表2 取食不同寄主灰飛虱的3種解毒酶活性

3 結論與討論

寄主植物誘導的昆蟲對藥劑敏感性變化通常有3種情況：敏感性上升、下降或基本保持不變(Wangetal.，2010；Xueetal.，2010)。已有研究發(fā)現(xiàn)，取食不同寄主后的朱砂葉螨對聯(lián)苯菊酯的敏感性無變化(戴宇婷等，2013)。本研究也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)取食水稻、小麥和雜草3代后，灰飛虱3齡若蟲對三氟苯嘧啶的敏感性無變化，對吡蟲啉、噻蟲嗪和溴氰蟲酰胺的敏感性變化也較小。但也有很多研究表明，取食不同寄主植物后，害蟲對藥劑的敏感性變化較大(Karuppaiahetal.，2016)。這種變化與寄主植物的營養(yǎng)條件、次生代謝物質的種類和含量、昆蟲種類與發(fā)育階段以及外界環(huán)境溫度等條件有關(姚洪渭等，2002；張睿，2011)，與供試藥劑的種類也有關系(Xieetal.，2011)。本研究也發(fā)現(xiàn)，取食不同寄主植物后灰飛虱對不同藥劑敏感性變化也存在不同。此外，誘導時間較短，這可能是寄主植物對灰飛虱藥劑敏感性影響較小的一個原因。

寄主植物在影響害蟲生長發(fā)育的同時也可以誘導昆蟲體內的解毒酶系統(tǒng)發(fā)生變化(呂朝軍等，2007；呂敏等，2012)。ESTs、GSTs和MFO均是昆蟲體內重要的解毒酶，能夠被不同寄主植物誘導，在對次生代謝物質和外源化合物的解毒代謝和對殺蟲劑的抗性機制中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，用不同寄主植物飼養(yǎng)灰飛虱3代后，灰飛虱3齡若蟲體內的ESTs、GSTs和MFO 3種解毒酶活性存在明顯差異，取食稗草后的灰飛虱體內3種解毒酶活性要明顯高于取食小麥的灰飛虱。盡管發(fā)現(xiàn)取食不同寄主植物后的灰飛虱對藥劑的敏感性變化較小，但取食小麥后的灰飛虱對藥劑的敏感性均要高于稗草的趨勢。因此，這種變化趨勢很可能是不同次生代謝物質誘導解毒酶活性變化導致。但是哪種解毒代謝酶起主要作用，還需進一步研究。

在包括中國的東亞地區(qū)，小麥和水稻輪作系統(tǒng)中的小麥、水稻和雜草均可為灰飛虱提供足夠的食物(Huangetal.，2018；Lietal.，2019)。本研究結果表明，取食水稻、小麥和稗草后的灰飛虱的解毒酶活性存在差異，同時灰飛虱對殺蟲劑的敏感性也發(fā)生了一定的變化。研究結果不僅對灰飛虱的田間綜合防治具有重要的意義，也有助于我們更好的理解灰飛虱對寄主植物的生理生化適應機制。