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    STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt軸在先天性巨結(jié)腸病變組織中的表達(dá)

    2021-05-14 03:04:24季春宜尹強(qiáng)袁妙賢陳立健謝惟心
    中國(guó)普通外科雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:室溫免疫組化結(jié)腸

    季春宜,尹強(qiáng),袁妙賢,陳立健,謝惟心

    (湖南省兒童醫(yī)院 普外一科,湖南 長(zhǎng)沙 410007)

    先天性巨結(jié)腸(hirschsprung disease,HD)是一種以腸道神經(jīng)系統(tǒng)先天性缺陷為主要病理特征的復(fù)雜遺傳性消化道異常病變,其病變機(jī)制與多種易感基因的異常表達(dá)密切相關(guān),進(jìn)而介導(dǎo)結(jié)腸神經(jīng)異常發(fā)育,腸管失去正常蠕動(dòng)發(fā)生痙攣、便秘和腹脹等多種臨床癥狀[1-3]。臨床上手術(shù)切除術(shù)仍是針對(duì)HD患者的有效治療手段,而關(guān)于HD患者腸管動(dòng)力障礙的病理生理機(jī)制尚不明確。近年來(lái),有關(guān)HD 患者的結(jié)腸動(dòng)力障礙機(jī)制的研究主要以結(jié)腸炎性病變?yōu)榻裹c(diǎn)[4-5]。研究[6-8]報(bào)道,信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)蛋白家族在多種遺傳性疾病中異常表達(dá),進(jìn)而介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體、Toll樣受體、IL-6受體等信號(hào)通路被激活,持續(xù)性的STAT3活化導(dǎo)致下游信號(hào)基因及信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和異常表達(dá),從而促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。此外,研究[9]表明STAT3作為特異性炎癥調(diào)控因子,既能維持疾病進(jìn)展所需炎性環(huán)境,同時(shí)發(fā)揮較強(qiáng)的機(jī)體抗炎免疫應(yīng)答。然而,STAT3在HD進(jìn)程中的表達(dá)及意義尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文探討HD患者結(jié)腸病變組織中STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路中主要蛋白表達(dá)的變化,以期為揭示臨床HD患者結(jié)腸動(dòng)力障礙作用機(jī)制提供新視角和治療靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    先天性巨結(jié)腸患兒病變及正常結(jié)腸組織源自湖南省兒童醫(yī)院;S-P免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymed生物公司;PCR引物由上海吉瑪生物公司合成;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑購(gòu)自日本Takara生物公司;STAT3、KLF4、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH一抗分別購(gòu)自英國(guó)Abcam和美國(guó)Cell Signaling Technology生物公司;辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 S-P 免疫組化染色檢測(cè)STAT3 組織陽(yáng)性表達(dá)及定位將上述HD 患者的結(jié)腸病變和正常組織經(jīng)石蠟切片為4~5 μm 組織薄片后脫蠟,滴加3%甲醇雙氧水室溫靜止10 min 以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;采用0.01 mol/L(pH7.2)的PBS 緩沖液室溫清洗3 次,5 min/次。隨后滴加0.01 mol/L(pH6.0)的檸檬酸緩沖液于微波爐中煮沸2 次以進(jìn)行組織抗原修復(fù)。取出薄片待自然冷卻后采用PBS 清洗后加入二抗同源動(dòng)物非免疫血清室溫封閉10 min,隨后滴加適度比例稀釋的STAT3 一抗4 ℃過(guò)夜;次日,取出薄片采用PBS 室溫清洗3 次,5 min/ 次,滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育10 min,PBS 洗PBS 室溫清洗3 次,5 min/ 次;滴加鏈親和素- 過(guò)氧化物酶室溫靜置10 min,PBS 洗PBS 室溫清洗 3 次,5 min/ 次。最后采用新鮮配制的DAB 溶液室溫顯色并密切觀察組織染色情況,自來(lái)水洗后,采用蘇木素淺染細(xì)胞核,分化;最后用自來(lái)水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片,顯微觀察上述分子的組織表達(dá)及分布情況并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和拍照記錄。染色結(jié)果根據(jù)細(xì)胞著色程度差異分級(jí)表示,(-)表示陰性細(xì)胞,(+)表示淡棕黃色細(xì)胞,(++)表示處于淡棕黃色和深棕黃色之間的細(xì)胞,(+++)表示深棕黃色[10]。

    1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)RNA 表達(dá)采用TRIzol 裂解液提取上述收集HD 患者結(jié)腸病變組織和正常組織總RNA,采用Takara 公司5×PrimeScript RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA,qRT-PCR嚴(yán)格按照Takara 公司2×SYBR Premix Ex Taq II說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用儀器自帶軟件進(jìn)行分析,基因相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算,以GAPDH 作為內(nèi)參基因,檢測(cè)組織樣本中STAT3、miR-92a、KLF4、PI3K 和Akt 的RNA 表達(dá)水平,qRT-PCR引物序列如表1。

    表1 qRT-PCR 引物序列

    1.2.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)采用適量PIPA+PMSF 組織裂解液裂解上述收集HD 患者結(jié)腸病變組織和正常組織總蛋白,室溫靜置5 min,4 ℃離心機(jī)12 000r/min 離心15 min,取上清置于新的1.5 mL 的EP 管中,記錄蛋白總體積。采用BCA 法檢測(cè)蛋白初始濃度并計(jì)算30 μg 蛋白上樣體積,采用SDS-PAGE 蛋白凝膠進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜,5% 脫脂牛奶封閉后,采用適當(dāng)比例稀釋的STAT3、KLF4、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 和GAPDH 一抗稀釋液4 ℃過(guò)夜孵育;次日,棄一抗,采用TBST 室溫清洗后與1:3 000 比例稀釋的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h,采用TBST 室溫清洗后,采用ECL 發(fā)光儀和Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并記錄蛋白表達(dá)量并進(jìn)行灰度掃描分析,每組樣品重復(fù)3 次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 7軟件。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;采用Spearman進(jìn)行相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 S-P 免疫組化檢測(cè)STAT3 的組織陽(yáng)性表達(dá)及定位情況

    S-P 免疫組化檢測(cè)H D 患者結(jié)腸病變組織中STAT3的陽(yáng)性表達(dá)及定位結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常結(jié)腸組織[(28.35±2.45)個(gè)vs.(14.24±3.67)個(gè),P<0.05]。

    2.2 qRT-PCR 檢測(cè)STAT3 及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號(hào)軸分子RNA 表達(dá)

    qRT-PCR檢測(cè)HD患者結(jié)腸病變組織中STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號(hào)軸分子RNA表達(dá),結(jié)果表明,H D 患者病變結(jié)腸組織中STAT3、miR-92a和KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路標(biāo)志分子RNA表達(dá)較正常組織均明顯上調(diào)(均P<0.05)(圖2)。

    圖1 S-P 免疫組化檢測(cè)HD 患者結(jié)腸組織中STAT3 的表達(dá)與分布情況(×40)

    圖2 qRT-PCR 檢測(cè)STAT3 及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號(hào)軸分子RNA 表達(dá)

    2.3 Western blot 檢測(cè)檢測(cè)STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號(hào)軸分子蛋白表達(dá)

    Westernblot檢測(cè)HD患者結(jié)腸病變組織中STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號(hào)軸分子蛋白表達(dá),結(jié)果表明,HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3、KLF4、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)較正常組織均明顯上調(diào)(均P<0.05),而PI3K和Akt表達(dá)量?jī)烧咧g差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(圖3)。

    2.4 HD 患者結(jié)腸病變組織中STAT3 和miR-92a的相關(guān)性

    相關(guān)性分析結(jié)果表明,HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3 和miR-92a的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.992,P=0.003)。

    圖3 Western blot 檢測(cè)STAT3 及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt 信號(hào)軸分子蛋白表達(dá)

    3 討 論

    HD是臨床小兒高發(fā)的腸道疾病,其誘因和發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明明確。研究發(fā)現(xiàn)多種因素包括機(jī)體近端腸管機(jī)械性擴(kuò)張、腸道感染、腸黏膜機(jī)械障礙、黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞減少以及基因表達(dá)異常均與HD的發(fā)生發(fā)展有關(guān),上述因素均可導(dǎo)致患者腸管擴(kuò)張產(chǎn)生腹脹、爆發(fā)行水樣瀉、發(fā)熱等非典型癥狀。嚴(yán)重者腸神經(jīng)元的缺失導(dǎo)致病變節(jié)段的緊張性收縮,導(dǎo)致功能性胃腸道梗阻[11-12]。臨床上針對(duì)HD的治療方法是手術(shù)切除術(shù)腸管并進(jìn)行結(jié)腸肛管吻合術(shù)[13]。然而,結(jié)腸受累程度不僅影響患者臨床表現(xiàn),而且影響預(yù)后和可用的治療方案。盡管手術(shù)治療對(duì)患者具有一定臨床效果,但全結(jié)腸和小腸/廣泛的梗阻患者較高的病死率以及患者術(shù)后較高的大小便失禁和便秘發(fā)生率大大降低臨床療效與滿意度[14]。因此,尋找有效的治療手段或治療靶點(diǎn)成為臨床HD患者治療的重要難題。

    目前關(guān)于HD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,研究表明可能與基因多態(tài)性、腸黏膜屏障受損、慢性持續(xù)性炎癥等因素有關(guān)[15]。炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT3及家族成員在多種炎性病變組織內(nèi)呈異常過(guò)表達(dá),且與患者的病變程度密切相關(guān)。STAT3作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子,能夠調(diào)控下游多種細(xì)胞因子的表達(dá)和信號(hào)通路活性,參與機(jī)體多種生理病理進(jìn)程[16]。近年來(lái)大量研究證實(shí)STAT3炎性信號(hào)通路在多種惡性腫瘤中異?;罨⒛軌虼龠M(jìn)惡性腫瘤的炎-癌轉(zhuǎn)化,靶向STAT3信號(hào)有望為臨床抗腫瘤治療提供新靶點(diǎn)[17-18]。STAT3是最常見(jiàn)的炎癥標(biāo)志物,可能參與HD的發(fā)病過(guò)程。本研究采用免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3的陽(yáng)性表達(dá)較正常結(jié)腸組織顯著升高,提示STAT3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在誘發(fā)HD進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

    miR-92a是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的較小的非編碼RNA,能夠參與體內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控繼而參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生物學(xué)信號(hào)通路[19]。最新研究發(fā)現(xiàn),miR-92a的突變或異常表達(dá)與多種人類炎性反應(yīng)以及惡性腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)[20]。研究表明多種機(jī)體炎性疾病中miR-92a表達(dá)上調(diào),進(jìn)而抑制機(jī)體抗炎能力,促進(jìn)炎癥反應(yīng)的持續(xù)以及腫瘤的炎-癌轉(zhuǎn)化進(jìn)程,在臨床慢性致炎疾病的診療中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究報(bào)道致炎因子STAT3的異常表達(dá)能夠上調(diào)miR-92a的表達(dá),繼而參與調(diào)控炎癥進(jìn)展,然而HD患者病理進(jìn)程中兩者之間的相互作用及對(duì)對(duì)疾病影響尚無(wú)明確報(bào)道[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HD患者病變組織中STAT過(guò)表達(dá)能夠顯著上調(diào)miR-92a的轉(zhuǎn)錄水平,提示STAT3和miR-92a的相互作用在促進(jìn)HD患者病變進(jìn)程中發(fā)揮協(xié)同作用。

    KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的經(jīng)典信號(hào)通路,在介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、自噬、凋亡等多種進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[23-24]。研究[25]顯示,KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路異?;罨軌蛘T導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生和進(jìn)展。另外,在持續(xù)炎癥環(huán)境下,活化的Akt還可以激活NF-κB,提高病變組織內(nèi)TNF-α、IL-6等促炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平,擴(kuò)大炎癥反應(yīng),加重組織損傷[26]。本研究通過(guò)對(duì)比HD患者結(jié)腸病變及正常組織中KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路標(biāo)志分子活性,結(jié)果顯示HD患者病變結(jié)腸組織中KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路標(biāo)志分子的總RNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常結(jié)腸組織。此外,相關(guān)性分析結(jié)果表明HD患者病變結(jié)腸組織中STAT3和miR-92a的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.992,P=0.003)。綜上所述,致炎信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子STAT3通過(guò)上調(diào)miR-92a的轉(zhuǎn)錄水平,介導(dǎo)KLF4/PI3K/Akt信號(hào)通路活化,誘導(dǎo)先天性巨結(jié)腸的發(fā)生發(fā)展,靶向STAT3及其下游miR-92a/KLF4/PI3K/Akt信號(hào)軸,有望為臨床先天性巨結(jié)腸的預(yù)防及診療提供新治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

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