預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后免疫相關(guān)基因?qū)?biāo)志模型的構(gòu)建及驗證

徐文迪，田那科·沙帕爾，劉奎杰，韓同，趙華

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 胃腸外科，湖南 長沙 410011）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種全球性的常見病，是已知癌癥中第三大最常見類型，占全世界癌癥死亡主要原因的第二位[1]。據(jù)統(tǒng)計，在2018年，我國CRC新發(fā)病例數(shù)為521 590，占所有癌癥新發(fā)病例的12.2%。因罹患CRC而死亡的病例數(shù)為247 563，占所有癌癥病死率的8.6%[2]。而最新的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)表明，預(yù)計到2021年，僅美國就將有104 270例新增CRC癌癥病例及52 980例癌癥死亡病例[3]。

中國大多數(shù)CRC是結(jié)腸腺癌（colon-adenocarcinoma，COAD）是發(fā)生于腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是結(jié)腸癌最主要的病理類型之一。其他罕見類型包括鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌、梭形細(xì)胞癌和未分化癌[4-5]。CRC是一種異質(zhì)性疾病，大約60%～65%的病例是偶發(fā)的，是通過獲得性體細(xì)胞遺傳和表觀遺傳變異引起的，這些變異主要歸因于可改變的潛在風(fēng)險因素[6]。CRC患者的預(yù)后取決于癌癥的TNM分期和是否接受治愈性手術(shù)干預(yù)，但這僅限于原發(fā)早期的CRC患者。此外，CRC患者的臨床表現(xiàn)，治療效果和預(yù)后還受到例如表觀遺傳狀態(tài)和導(dǎo)致CRC異質(zhì)性的微環(huán)境等許多因素的影響[7]。

諸多研究表明，確定能夠早期進(jìn)行診斷，準(zhǔn)確監(jiān)測患者病情發(fā)展及其對治療的反應(yīng)的生物標(biāo)志物，對CRC患者進(jìn)行早期診斷或切除是治愈大多數(shù)CRC患者的關(guān)鍵[8-9]。對于CRC的不良預(yù)后和高復(fù)發(fā)率，盡管最近的研究中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物對改善CRC的診斷和治療做出了巨大貢獻(xiàn)[10-14]。但由于各種原因，諸如對小型發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的過度擬合和缺乏足夠的臨床驗證之類的問題，將便捷精確的篩選生物標(biāo)志物的方法納入常規(guī)臨床實踐仍未實現(xiàn)。

近年來，由于飛速發(fā)展的微陣列技術(shù)和高通量測序技術(shù)，為尋找與癌癥相關(guān)診斷、治療和預(yù)后的關(guān)鍵的生物標(biāo)志物提供了數(shù)據(jù)平臺[15]。但由于數(shù)據(jù)的多樣性及數(shù)據(jù)集之間潛在的生物學(xué)異質(zhì)性和跨測量平臺的技術(shù)偏見，以及研究基因表達(dá)水平所使用的傳統(tǒng)方法需要適當(dāng)?shù)臍w一化，這些困難的任務(wù)為高效地利用生物信息帶來了艱巨的挑戰(zhàn)[16]。為了應(yīng)對消除數(shù)據(jù)預(yù)處理（例如縮放和歸一化）局限性的問題，研究人員提出了一種基于基因表達(dá)水平相對排名的方法，已在包括癌癥分類在內(nèi)的各種應(yīng)用中均可得到可靠結(jié)果[17-19]。

研究[20-21]表明，免疫逃逸、能量異常、基因突變、促瘤炎癥成為了新的腫瘤標(biāo)志。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中所涉及的免疫系統(tǒng)的各種成分已被證明是癌癥的關(guān)鍵性因素[22-23]。

本研究探討一種由免疫相關(guān)基因（immunerelated gene，IRG）組成的免疫相關(guān)基因?qū)χ笖?shù)（immune-related gene pair index，IRGPI）為預(yù)后標(biāo)志模型的構(gòu)建，并且在癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)集中與CRC患者的臨床信息相關(guān)聯(lián)后對其進(jìn)行了一系列的研究，從而證明免疫相關(guān)基因?qū)Γ↖RGP）與CRC患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過公開數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性研究。本研究選擇了2個獨立數(shù)據(jù)集，包括TCGA-COAD（臨床數(shù)據(jù)集452例，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集449例）以及GSE39582（585例）[24]，數(shù)據(jù)收集的時間為2020年4月25日—6月20日。其中TCGA-COAD數(shù)據(jù)集因其高質(zhì)量的臨床記錄及完善的長期隨訪而被用作訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，其臨床信息、基因表達(dá)矩陣從TCGA門戶（https://portal.gdc.cancer.gov）下載。為了驗證TCGA數(shù)據(jù)集中的研究結(jié)果，從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載了驗證數(shù)據(jù)集GSE39582中的基因表達(dá)矩陣和臨床數(shù)據(jù)作為外部驗證。

對于TCGA-COAD及GEO數(shù)據(jù)集，基于每組注釋文件將表達(dá)譜從探針?biāo)睫D(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因符號，而沒有進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化。對于同一個基因符號對應(yīng)不同的表達(dá)值，將表達(dá)值其取均數(shù)。本研究通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查，僅將具有完整臨床生存信息的患者用于后續(xù)分析。

1.2 CRC 特異性IRGP 的構(gòu)建

進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)集預(yù)后IRGP的構(gòu)建[25]。于2020年3月28日從ImmPort數(shù)據(jù)庫（https://immport.niaid.nih.gov）下載了2 498個IRG用于構(gòu)建IRGP。IRG包含17類，其中包括腫瘤壞死因子家族成員、轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員、趨化因子及細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、干擾素等。

對本研究所涉及的TCGA及GEO平臺上進(jìn)行了變化相對較大（絕對偏差中值（median absolute deviation，MAD）＞0.5）的IRG的測量。對每個樣品中的IRG的表達(dá)值之間進(jìn)行成對比較，以獲得每個IRGP的得分。如果在特定IRGP中第1個IRG的表達(dá)水平高于第2個IRG，則該IRGP的得分為1。否則，分?jǐn)?shù)為0。去除變異相對較小的IRGP（80%以上的數(shù)據(jù)集樣本中IRGP的分?jǐn)?shù)為0或1，這意味著樣本之間變化很微?。┖螅Ｏ碌腎RGP被保留下來作為初始候選IRGP用于進(jìn)行后續(xù)分析。

這種基于基因成對比較的方法具有顯著優(yōu)勢，因為該方法是完全基于腫瘤樣本的基因表達(dá)譜來計算的得分，可以不需要標(biāo)準(zhǔn)化而以個性化的方式使用[22]。

1.3 IRGPI 的構(gòu)建

為得到最穩(wěn)定的基因?qū)δＰ蛠順?gòu)建預(yù)后標(biāo)志，將TCGA-COAD數(shù)據(jù)集以及GEO數(shù)據(jù)集中的臨床數(shù)據(jù)整理，得到CRC患者樣本中的生存時間及生存狀態(tài)，將其與初始IRGP相合并，運用Cox回歸及Kaplan-Meier法選擇與CRC預(yù)后顯著相關(guān)的IRGP（P＜0.001）。為了避免數(shù)據(jù)過度擬合的風(fēng)險，選擇預(yù)后顯著相關(guān)的IRGP，使用R軟件包“glmnet”（版本：3.0-2）應(yīng)用Lasso-Cox回歸（迭代1 000次），并最終選擇了20個IRGP定義為最終IRGPI。

使用R 語言包“survivalROC”（版本：1.0.3）、“survival”（版本：3.1-11）構(gòu)建時間依賴性受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，用以確定IRGPI的最佳截止（cut-off）值，從而將CRC患者分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。

1.4 IRGPI 的驗證

為了評估IRGPI標(biāo)志的價值，首先通過Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗對CRC患者繪制了生存曲線。隨后選擇了高-低風(fēng)險組的相關(guān)臨床因素，通過單變量和多變量Cox比例風(fēng)險分析來評估IRGPI。在單變量分析中，針對每個數(shù)據(jù)集中的臨床因素、病理因素及IRGPI進(jìn)行了風(fēng)險評分。隨后，在多變量Cox分析中將IRGPI與可用的臨床和病理變量相結(jié)合，年齡、性別及T、N分期被視為連續(xù)變量，從而進(jìn)一步對IRGPI進(jìn)行評估。

1.5 浸潤免疫細(xì)胞的分析

采用一種可預(yù)測新鮮，冷凍及固定組織（包括實體瘤）免疫細(xì)胞浸潤的流行算法，CIBERSORT[26]，以便用于了解不同風(fēng)險人群的免疫細(xì)胞浸潤。CIBERSORT是一種從復(fù)雜組織的基因表達(dá)譜中表征其細(xì)胞組成的方法，對于緊密相關(guān)的細(xì)胞類型方面優(yōu)于其他方法。CIBERSORT對腫瘤樣品進(jìn)行去卷積算法，對于每種細(xì)胞類型都使用了支持向量回歸[27]。對于每個樣品，CIBERSORT能夠推斷出22種浸潤免疫細(xì)胞的相對比例。使用R軟件包“CIBERSORT R script”（版本：1.03）對每一個樣本進(jìn)行了浸潤免疫細(xì)胞的相對比例的計算。

1.6 功能注釋和分析

為了在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上了解構(gòu)成IRGPI的IRG的真實表達(dá)，使用了人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA，https://www.proteinatlas.org/）。HPA是一個可公開獲得的數(shù)據(jù)庫，包含近20種常見癌癥的基于免疫組織化學(xué)的表達(dá)數(shù)據(jù)，并且可提供一張基于組織和器官及微陣列的免疫組化的人類組織蛋白質(zhì)組圖譜。從而顯示了不同正常組織和癌癥組織中蛋白質(zhì)的空間分布[28-29]。

為了能夠了解IRGPI的相關(guān)生物學(xué)功能，本研究通過R 語言包“cluster Profiler”（版本：3.14.3）對構(gòu)成IRGPI的IRG進(jìn)行了基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。為了明確高風(fēng)險和低風(fēng)險組之間顯著改變的G O 途徑，在兩基因組間使用Bioconductor軟件包“FGSEA”（版本，1.12.0）進(jìn)行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[30]。本研究中涉及的生物學(xué)過程是使用了MSigDB（Molecular Signatures Database）標(biāo)記基因集，選擇P＜0.05的數(shù)據(jù)作為有統(tǒng)計學(xué)意義的基因集。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計檢驗均使用R 語言軟件（版本3.6.1，https//www.r-proje ct.org/）及SPSS軟件（SPSS version 22）進(jìn)行。對于所有測試，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IRGPI 的構(gòu)建及定義

整個工作流程如圖1所示。本研究共納入有完整臨床數(shù)據(jù)的1 018個樣本（表1）。TCGA-COAD隊列作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，GSE39582隊列作為驗證數(shù)據(jù)集。從ImmPort數(shù)據(jù)庫獲得的2 498個IRG來構(gòu)建IRGP。在所有數(shù)據(jù)集中均進(jìn)行了測量，并滿足訓(xùn)練集上的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（中位絕對偏差MAD＞0.5）后，共挑選出有473個IRG，并且構(gòu)建了個111 392個IRGP。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中刪除相對變異較小的IRGP之后，得到12 275個IRGPs。隨即合并樣本臨床信息，選擇有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）的28個IRGP作為初始候選IRGP。對于初始候選IRGP使用了Lasso Cox比例風(fēng)險回歸并且經(jīng)過了1 000次的隨機(jī)循環(huán)，最終選擇了20個IRGP構(gòu)成IRGPI。IRGPI由28個唯一的IRG組成（表2）。

圖1 構(gòu)建及驗證與CRC 患者IRGP 標(biāo)志的工作流程Figure 1 The workflow of constructing and verifying the IRGP signature in CRC patients

表1 TCGA-COAD 和GSE39582 數(shù)據(jù)集患者的臨床特征Table 1 Patient demographics and clinical characteristics in TCGA-COAD and GSE39582 datasets

表2 IRGPI 的相關(guān)信息Table 2 Information on the IRGPI

2.2 IRGPI 的驗證和評估

時間相關(guān)的ROC曲線IRGPI最佳截止值為-1.239（圖2）。根據(jù)CRC患者總生存率（overall survival，OS），使用IRGPI的最佳截止值將訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的患者分為低風(fēng)險和高風(fēng)險組（表1）。根據(jù)分析可知高風(fēng)險組的OS明顯低于低風(fēng)險組（P=1.295×10-11，HR=6.51，95%CI=3.79～11.21）（圖3A）。

對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析，以便于進(jìn)一步了解IRGPI是否可以作為CRC患者的獨立預(yù)后因素。在單變量Cox分析中，患者的年齡及腫瘤的T、N分期以及IRGPI對預(yù)后的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義。在多變量分析中，IRGPI標(biāo)記仍舊是一個獨立的預(yù)后相關(guān)因素（圖4A-B）。為了明確在不同人群中IRGPI是否具有與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集類似的預(yù)后價值，將相同的公式應(yīng)用于驗證數(shù)據(jù)集（GSE39582）作為外部驗證。按照與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集同樣的分組標(biāo)準(zhǔn)，將驗證數(shù)據(jù)集的患者分為高風(fēng)險和低風(fēng)險組，然后進(jìn)行相關(guān)生存分析后可得到與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集類似的結(jié)果。高風(fēng)險組的OS明顯低于低風(fēng)險組（P=0.000 1，HR=1.82，95%CI=1.36～2.44）（圖3B）。在驗證數(shù)據(jù)集中，仍舊采用單變量和多變量Cox回歸分析。最終分析結(jié)果表示：無論在單變量以及多變量Cox回歸分析當(dāng)中，IRGPI均有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，IRGPI標(biāo)記為影響CRC患者生存預(yù)后的獨立因素（圖4C-D）。

2.3 高、低風(fēng)險組中的免疫細(xì)胞浸潤

前期研究[23,31]顯示，CRC細(xì)胞凋亡與其微環(huán)境中免疫細(xì)胞凋亡和浸潤程度密切相關(guān)。CIBERSORT已經(jīng)用于癌癥微環(huán)境的相關(guān)研究中，其可以對實體腫瘤樣品進(jìn)行去卷積從而估計免疫細(xì)胞亞群[32-33]。本研究使用CIBERSORT來評估不同風(fēng)險組中每位患者的22種不同免疫細(xì)胞的相對比例。圖5A描繪了高-低風(fēng)險組使用CIBERSORT輸出的免疫細(xì)胞豐度的匯總，不同的風(fēng)險組所浸潤的免疫細(xì)胞表達(dá)量有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）（P=0.007）巨噬細(xì)胞（M0）（P=0.024）在高風(fēng)險組中顯著高表達(dá)，而在低風(fēng)險組中靜息樹突狀細(xì)胞（dendritic cells resting，P=0.006），靜息CD4+記憶T細(xì)胞（P=1.784e-05）的百分比明顯升高（圖5B）。

圖2 訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中IRGPI 的ROC 曲線 Figure 2 ROC curve of IRGPI in training dataset

圖3 高、低風(fēng)險組之間的CRC 患者的OS 曲線 A：訓(xùn)練數(shù)據(jù)集；B：驗證數(shù)據(jù)集Figure 3 OS curves of CRC patients in high-risk group and low-risk group A: Training dataset; B: Validating dataset

圖4 CRC 患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析的森林圖 A：基于單因素分析評價IRGPI 對TCGA-COAD 中CRC 患者預(yù)后的價值；B：基于多因素分析評價IRGPI 對TCGA-COAD 中CRC 患者預(yù)后的價值；C：基于單因素分析IRGPI 對GSE39582 中CRC 患者預(yù)后的價值；D：基于多因素分析IRGPI 對GSE39582 中CRC 患者預(yù)后的價值Figure 4 Forest plot of univariate and multivariate Cox regression analysis for the prognosis of CRC patients A: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TCGA-COAD based on univariate analysis; B: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TCGA-COAD based on multivariate analysis; C: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in GSE39582 based on univariate analysis; D: Prognostic value of IRGPI in CRC patients in TGSE39582 based on multivariate analysis

圖5 CRC 患者高、低風(fēng)險組中的免疫細(xì)胞浸潤分析 A：CIBERSORT 評估了高、低風(fēng)險組中22 種免疫細(xì)胞豐度；B：特定免疫細(xì)胞在高、低風(fēng)險組中的豐度分布Figure 5 Analysis of immunocyte infiltration in high and low risk groups of CRC patients A: CIBERSORT evaluation of the abundance of 22 immune cells in high and low risk groups; B: Abundance distribution of specific immune cells in high and low risk groups

2.4 IRGPI 的功能注釋

為了驗證此模型中的IRG在組織蛋白中的表達(dá)，使用HPA 數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學(xué)法分析了正常人組織和CRC組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。結(jié)果表明，與正常組織比較，CRC 組織中的APOD、ARG2、BST2、CCL28、CCL4、CD86、LCK、NR3C2、PTGS2、RBP1、RBP7、STC2、TNFRSF11A的表達(dá)上調(diào)（圖6）。為了解IRGPI標(biāo)志所涉及的相關(guān)生物學(xué)過程，對構(gòu)成IRGPI的28個IRG進(jìn)行了KEGG及GO富集分析。從KEGG的分析結(jié)果顯示，28個IRG所涉及的主要通路有：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路等（圖7A-B）（表2）。而GO分析表明，IRGPI中的相關(guān)IRG涉及的分子功能（MF）有：受體配體活性、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能。所涉及的生物過程（BP）有：白細(xì)胞遷移、細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)等過程。而涉及的細(xì)胞組成（CC）大致包括：膜區(qū)、分泌顆粒膜、免疫突觸等成分（圖7 C）。對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的高、低風(fēng)險組之間進(jìn)行了GSEA分析，以研究顯著改變的GO過程?；贕SEA 的分析表明，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中高-低風(fēng)險組之間顯著改變的生物學(xué)過程主要有：角化細(xì)胞分化、角化、表皮細(xì)胞分化、皮膚發(fā)育等過程 （圖7 D-E）。與腫瘤相關(guān)的功能注釋提供了IRGPI標(biāo)記影響分子機(jī)制的證據(jù)，從而可用于準(zhǔn)確預(yù)測CRC患者的預(yù)后。

圖6 CRC 組織中的蛋白質(zhì)免疫組織化學(xué)法的表達(dá)（×100）Figure 6 Expression of protein in CRC tissue by immunohistochemical method (×100)

圖7 IRGPI 的功能富集分析 A-B：28 個免疫特征基因的KEGG 富集分析結(jié)果；C：28 個免疫特征基因的GO 富集分析結(jié)果； D：高、低風(fēng)險組之間顯著改變途徑（角化，角質(zhì)形成細(xì)胞分化，表皮細(xì)胞分化，皮膚發(fā)育）的GSEA 分析結(jié)果； E：28 個免疫特征基因的基因集富集分析（GSEA）結(jié)果Figure 7 Functional enrichment Analysis of IRGPI A–B: Results of KEGG enrichment analysis of 28 immune characteristic genes; C: Results of GO enrichment analysis of 28 immune characteristic genes; D: GSEA analysis for significantly changed pathways between high and low risk groups (keratinization, epidermal cell differentiation, and skin development); E: Enrichment analysis (GSEA) 28 immune characteristic genes

3 討 論

隨著高速發(fā)展的微陣列技術(shù)和高通量測序技術(shù)，生物信息學(xué)技術(shù)成為了可以用于篩選生物標(biāo)志物的強(qiáng)有力工具。并且在多種類癌癥中得到了相關(guān)的應(yīng)用及驗證[34-36]。針對于高發(fā)病率的CRC，我國目前的采取以手術(shù)治療為主，多學(xué)科綜合治療的原則。而就包括了目前正處于高速發(fā)展階段的免疫治療[37]。在之前有關(guān)免疫治療的研究中所提及的：在轉(zhuǎn)移性CRC患者錯配修復(fù)缺陷治療中取得明顯療效的抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）藥物，使得CRC的免疫治療得到了進(jìn)一步的重視[38]。為了達(dá)到增加患者生存，延緩腫瘤進(jìn)展的目的，免疫治療可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，激發(fā)腫瘤特異性免疫，打破免疫耐受，重新激活免疫細(xì)胞等途徑從而識別并殺傷腫瘤細(xì)胞[39]。目前，比較熱門的免疫治療方式有腫瘤疫苗、免疫檢查點抑制劑以及小分子治療等，免疫治療在一定程度上改善了CRC 患者的預(yù)后，是一種有前景的治療選擇[40]。

對于CRC的不良預(yù)后和高復(fù)發(fā)率，盡管最近的國內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物對改善CRC的診斷和治療做出了巨大貢獻(xiàn)[41-43]，但是從生物的復(fù)雜性，個體差異，以及免疫因素的考慮，迫切需要找到強(qiáng)有力的預(yù)后生物標(biāo)志物來預(yù)測CRC患者的生存情況，從而對CRC患者采取相應(yīng)的治療措施。本研究成功構(gòu)建了一種由28個IRG組成的20個IRGP作為預(yù)后標(biāo)志，并且在TCGA和GEO數(shù)據(jù)集中均得到了其準(zhǔn)確性的驗證，從而充分證明了IRGPI是與CRC患者預(yù)后相關(guān)的重要因素。

本研究詳細(xì)分析了這些構(gòu)成IRGPI的IRG，參與構(gòu)建20對IRGP的大多數(shù)基因是細(xì)胞因子、抗菌劑家族成員，它們對于免疫微環(huán)境的構(gòu)成中扮演者重要角色。通過HPA數(shù)據(jù)庫的分析可知，CRC組織中的APOD、ARG2、BST2、CCL28、CCL4、CD86、LCK、NR3C2、PTGS2、RBP1、RBP7、STC2、TNFRSF11A基因在蛋白表達(dá)水平上較正常組織上調(diào)，表明這些基因在CRC組織中更為活躍。而在以前的研究中，提出APOD作為多種癌癥類型（包括CRC）的預(yù)后標(biāo)志物[44]；血清中AGR2參與了卵巢交界性腫瘤病情的發(fā)生、發(fā)展[45]； BTS-2的表達(dá)增強(qiáng)腎細(xì)胞癌的細(xì)胞生長和侵襲性[46]；胃癌組織中BST2 mRNA高表達(dá)，與腫瘤惡性程度有關(guān)，有望成為診斷胃癌新的生物標(biāo)志物。BST-2 參與了人巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移[47]；骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞通過CCR5促進(jìn)CRC的進(jìn)展[48]；INHBB在CRC中過表達(dá)，并與浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，與CRC的不良OS和DFS正相關(guān)[49]；肝硬化患者血清中炎性趨化因子如CCL4和CCL5的高水平表明存在肝細(xì)胞癌[50]；CCR7在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[51]；PTGS2表達(dá)與大腸癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險增加和大腸癌特異性生存率降低有關(guān)[52]；CCL28作為趨化因子，大量研究表明其在不同腫瘤中的表達(dá)異于正常組織，研究CCL28在腫瘤生成中的調(diào)控的具體作用機(jī)制有助于明確腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，為腫瘤的診療提供理論依據(jù)[53]；CRBP-1過表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān)[54]；RBP7的異位表達(dá)增加了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[55]；STC2是CRC患者OS的獨立預(yù)后因素，STC2高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，晚期臨床階段和較差的臨床結(jié)局密切相關(guān)[56]；根據(jù)前人的研究可知上述的基因參與了腫瘤發(fā)展和預(yù)后的過程，從而有助于合理的認(rèn)為本研究中構(gòu)建的IRGPI中的其他IRG也與CRC患者的預(yù)后相關(guān)，但仍需要進(jìn)一步的實驗進(jìn)行相關(guān)的驗證。

對于對IRG的功能注釋的結(jié)果可知IRGPI中一些基因在白細(xì)胞遷移、細(xì)胞趨化性、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用等過程中起關(guān)鍵作用。據(jù)相關(guān)研究表明，這些標(biāo)志所涉及的生物功能和途徑與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[57-61]。通過GSEA指出高風(fēng)險組中主要腹肌的過程有：角化細(xì)胞分化、角化、表皮細(xì)胞分化、皮膚發(fā)育等，以上途徑在之前的研究中亦可證明與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[62-64]。

根據(jù)對高-低風(fēng)險組的免疫分析，本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M0在高危組中顯著高表達(dá)。在過去的研究中，可知調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M0增多，對腫瘤免疫產(chǎn)生負(fù)面影響，并與不良預(yù)后相關(guān)[65-68]。而對于低風(fēng)險組高表達(dá)的靜息樹突狀細(xì)胞，腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞在直腸癌組織中低表達(dá)，不成熟細(xì)胞比例增加，與TNM分期和腫瘤直徑有關(guān)[22]。靜息CD4+記憶T細(xì)胞與腫瘤更好的預(yù)后相關(guān)[69]。以上這些研究結(jié)果表明，IRGPI標(biāo)記可作為CRC患者可靠的預(yù)后生物標(biāo)記物。

本研究采用了一種新的方法用于不同平臺數(shù)據(jù)的處理，相較于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志的研究是基于全基因組水平進(jìn)行的，本研究中所構(gòu)建的生物標(biāo)志是基于免疫相關(guān)基因而進(jìn)行的，并且采取了專門設(shè)計的分析流程及方法。傳統(tǒng)的生物信息學(xué)方法一般是根據(jù)正?；虬┡越M織與腫瘤組織的基因表達(dá)差異來進(jìn)行后續(xù)的研究，需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及克服跨平臺的偏見，而本研究基于同一樣本基因表達(dá)譜內(nèi)每一個基因表達(dá)值的相對排名而進(jìn)行的成對比較后得到的一組分值來構(gòu)建IRGP。不僅可以避免不同數(shù)據(jù)庫及平臺產(chǎn)生的技術(shù)偏見以及因生物學(xué)異質(zhì)性而帶來的不同腫瘤個體間的偏差[70-71]，而且也可以克服傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析需要預(yù)處理數(shù)據(jù)的難點。從而得到與其他研究相比重復(fù)率較低且穩(wěn)健的生物標(biāo)志。本研究所使用的新方法在包括癌癥在內(nèi)的許多研究中均具有可靠的結(jié)果[17-19,25,72]。因此本研究所構(gòu)建的生物標(biāo)志可以實現(xiàn)單樣本、精準(zhǔn)化、高效率地評估CRC患者的預(yù)后，這是本研究所具有的優(yōu)勢之一。

在本研究中，IRGPI標(biāo)志物的構(gòu)建是使用與傳統(tǒng)研究不同的Lasso回歸經(jīng)過了1 000次的迭代構(gòu)建的，它可以避免過度擬合從而確定最佳的變量。利用CRC患者ROC曲線分析確定的最佳截止值，將訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。經(jīng)過相關(guān)分析，兩組預(yù)后有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。Lasso回歸以及ROC曲線的最佳截止值的相關(guān)應(yīng)用還可適用于其他不同的數(shù)據(jù)集和臨床隊列，這也是本研究所具有的重要優(yōu)勢。

本研究依舊具有局限性。首先，本研究采取的是回顧性分析，本研究所涉及的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集及驗證數(shù)據(jù)集均使用公開數(shù)據(jù)庫中的樣本。雖然兩個大型公開數(shù)據(jù)庫擁有公認(rèn)的穩(wěn)定性及可靠性，但是對于數(shù)據(jù)庫中石蠟切片樣品的穩(wěn)定性和有效性仍有待進(jìn)一步考證。如需進(jìn)一步驗證研究結(jié)果，則需要進(jìn)行前瞻性隊列研究。其次，本研究中所涉及的基因表達(dá)特征會受到由腫瘤內(nèi)生物學(xué)異質(zhì)性及統(tǒng)計學(xué)偏差所帶來的影響。盡管使用了樣本量較大的TCGA及GEO兩個數(shù)據(jù)集，但仍舊需要包含具有不同樣本屬性的更多數(shù)據(jù)集，以進(jìn)行更廣泛的驗證。最后，本研究所使用的基因表達(dá)矩陣是基于RNA-seq或微陣列平臺產(chǎn)生的，由于其價格高，轉(zhuǎn)化周期長以及對生物信息學(xué)專業(yè)知識有較高要求而使其在日常臨床應(yīng)用中受到了一定的限制[73]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了由20個IRGPI標(biāo)志。并且了解它們作為一種生物標(biāo)志所擁有的預(yù)后價值。本研究中所構(gòu)建的IRGPI標(biāo)志是CRC患者的生存的獨立預(yù)后因素。通過進(jìn)一步生物學(xué)功能分析，可以了解這些IRGPI在CRC的發(fā)生發(fā)展中的功能，從而為CRC的治療方式提供了一種新的思路。該標(biāo)記或?qū)⒊蔀橐环N評價CRC患者是否能夠獲益于相關(guān)免疫治療的新型精準(zhǔn)化預(yù)測工具。