分散固相萃取結(jié)合通過式固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中5種罌粟殼生物堿

吳 瓊，扈明潔，江 海，勵(lì) 炯，邱紅鈺，李 瑋

(杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310017)

罌粟殼為罌粟科植物罌粟(PapavcrsominiferumL.)割取漿汁后的干燥成熟果殼，主要含有嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁五種生物堿[1]。食用這些含有生物堿的食品會(huì)使人嗜睡和性格改變，并造成食用者在心理、生理上產(chǎn)生強(qiáng)烈的依賴性，而長期食用則會(huì)危害人的神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[2]。目前，檢測火鍋底料中非法添加罌粟殼的方法主要有氣相色譜法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5,6]、液相色譜-質(zhì)譜法等[7 - 10]，其中液相色譜-質(zhì)譜法兼具靈敏度高及抗干擾性強(qiáng)的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于火鍋底料中非法添加罌粟殼的分析檢測。然而火鍋底料中含有大量的油脂和色素，基質(zhì)效應(yīng)較明顯，色譜-質(zhì)譜分離檢測前需對樣品進(jìn)行一定的前處理。林黛琴等[11]用正己烷來去除火鍋底料中的油脂和色素。近年來，有很多研究是用普通的固相萃取小柱來進(jìn)行樣品凈化[12 - 15]。這兩種凈化方式都存在因步驟繁瑣，操作不當(dāng)而造成待測物一定的損失，進(jìn)而影響定量的準(zhǔn)確性。

國家食品藥品監(jiān)督管理局國食藥監(jiān)食[2012]3號(hào)文件附件3 《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-質(zhì)譜法》、上海市食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)(DB 31/2010-2012)《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，以及一些文獻(xiàn)報(bào)道[16,17]中的前處理均采用了分散固相萃取技術(shù)。雖然該凈化方法簡便、快速、廉價(jià)，但一些油脂和色素含量高的樣品，特別是對火鍋底料的凈化效果一般，基質(zhì)效應(yīng)較為明顯。本研究在以分散固相萃取技術(shù)對火鍋底料進(jìn)行初步凈化的基礎(chǔ)上，再結(jié)合通過式固相萃取技術(shù)進(jìn)行深度凈化。本文建立的分散固相萃取，結(jié)合固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測火鍋底料中的5種罌粟殼生物堿，方法靈敏、簡便、高效，且操作簡單、迅速、準(zhǔn)確，能有效降低基質(zhì)干擾，可滿足火鍋底料的質(zhì)量監(jiān)測需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent-1290高效液相色譜儀-Agilent 6425串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；Mili-Q純水儀(美國，Millipore公司)；MS3旋渦混合器(德國，IKA公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸罌粟堿(批號(hào)：171214-201205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、蒂巴因(批號(hào)：171216-200403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)，中國食品藥品檢定研究院；嗎啡(批號(hào)FE031914-02，質(zhì)量濃度1.0 mg/mL)、可待因(批號(hào)：FE013113-03，質(zhì)量濃度1.0 mg/mL)，美國Cerilliant公司；那可丁(批號(hào)：N1300000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%)，European Phamacopoeia Reference Standard公司。甲酸銨、NaCl、無水Na2SO4均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購自德國Merck公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18-N)和氨丙基乙二胺吸附劑(NH2-PSA)購自上海島津技邇公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg)購自美國Waters公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取鹽酸罌粟堿、蒂巴因和那可丁標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用含0.5%甲酸的乙腈溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液(濃度為1 000 mg/L)。分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，以及嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)品適當(dāng)體積于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適當(dāng)體積，用乙腈稀釋成0.1、0.5、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

取2 g樣品，置于50 mL聚氟乙烯離心管中，加入2 mL水，精密加入8 mL乙腈，渦旋混合1 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液直接加載到PRiME HLB固相萃取柱上，流速為1滴/秒，收集全部流出液于25 mL聚氟乙烯離心管中，加入2 g NaCl和5 g無水Na2SO4，渦旋混合5 min，5 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至25 mL聚丙烯離心管中，待進(jìn)一步凈化。在待凈化樣液中加入凈化劑(內(nèi)含1 000 mg無水Na2SO4、300 mg C18-N及300 mg NH2-PSA)，旋渦混勻1 min，以5 000 r/min的速度離心5 min。準(zhǔn)確移取4.00 mL上清液于40 ℃下氮吹至干，0.5 mL流動(dòng)相復(fù)溶，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

Waters CORTECS UPLC HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動(dòng)相：A相為含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，B相為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5%～12%A；0.5～4.0 min，12%A；4.0～5.0 min，12%～5%A；5.0～6.0 min，5%A。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。

離子源：電噴霧電離，正離子模式(ESI+)掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：14 L/min；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；毛細(xì)管出口電壓(Fragmentor)：380 V；校準(zhǔn)方法：質(zhì)量軸自動(dòng)調(diào)諧校正；MRM進(jìn)行分段掃描：0～2.0 min，那可丁；2.0～2.8 min，鹽酸罌粟堿；2.8～3.9 min，蒂巴因；3.9～4.25 min，嗎啡；4.25～6.0 min，可待因。其他質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表1。

表1 5種罌粟殼生物堿的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

精密取濃度為0.5 mg/L的5種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入進(jìn)樣器，隨流動(dòng)相直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行MRM分析。發(fā)現(xiàn)5種罌粟殼生物堿在正離子模式下的穩(wěn)定性和重復(fù)性較負(fù)離子模式好，故本方法采用正離子模式進(jìn)行檢測。在正離子模式下對5種罌粟殼生物堿在m/z250～450范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，得到[M+H]+峰。確定母離子之后，調(diào)節(jié)離子源電壓，最終當(dāng)離子源電壓為3.5 kV時(shí)一級(jí)掃描響應(yīng)最高。確定母離子及其條件后，繼續(xù)進(jìn)行子離子掃描，確定母離子相應(yīng)的子離子，得到最佳的二級(jí)質(zhì)譜條件，經(jīng)儀器自帶的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)自動(dòng)優(yōu)化程序，得到5種目標(biāo)化合物的二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)(表1)。最終將優(yōu)化后得到的定量定性離子對和碰撞能量作為5種罌粟殼生物堿的掃描參數(shù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

圖1 5種罌粟殼生物堿(10 μg/L)MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 5 alkaloids from pericarpium papaveris(10 μg/L)Peak identifications:1.morphine；2.codeine；3.thebaine；4.papaverine；5.noscapine.

本文比較了Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(100 mm×2.1mm，1.7 μm)、Waters CORTECS UPLC HILIC柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) 4種色譜柱對5種罌粟殼生物堿的色譜行為。由于嗎啡和可待因兩種生物堿為強(qiáng)極性化合物，其在酸性條件下無色譜保留。簡龍海等[18]采用親水作用色譜柱來對罌粟殼生物堿進(jìn)行分析，國家食品藥品監(jiān)督管局國食藥監(jiān)食[2012]3號(hào)文件附件3《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-質(zhì)譜法》和上海市食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)DB 31/2010-2012《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》也采用該類型色譜柱。但本文在實(shí)際分析中發(fā)現(xiàn)使用該色譜柱分析時(shí)，嗎啡和可待因，罌粟堿、那可丁和蒂巴因分離度均比較差，質(zhì)譜分析過程中會(huì)產(chǎn)生競爭性離子抑制，降低各目標(biāo)物的靈敏度，所以我們選用Waters CORTECS UPLC HILIC柱作為罌粟殼生物堿的分析色譜柱。該分析柱采用實(shí)心核顆粒技術(shù)，5種生物堿能達(dá)到較好的分離效果，降低目標(biāo)物的競爭性離子抑制效果。5種罌粟殼生物堿的MRM色譜譜圖見圖1。

2.3 提取和凈化方式的優(yōu)化

分散固相萃取技術(shù)提取溶劑一般采用乙腈，而通過式固相萃取技術(shù)上柱溶液一般采用含一定比例水的乙腈溶液，罌粟殼生物堿的提取溶劑一般采用甲醇、乙腈等溶劑，所以本文采用80%乙腈溶液作為火鍋底料中罌粟殼生物堿的提取溶劑。樣品經(jīng)80%乙腈溶液提取后，提取液先經(jīng)過PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行初步凈化，然后再用含一定比例的無水Na2SO4、C18-N及NH2-PSA組成的凈化劑進(jìn)行進(jìn)一步凈化處理。本文通過正交試驗(yàn)對三種成分的配比進(jìn)行優(yōu)化，無水Na2SO4(一般為500～1 500 mg)、C18-N(一般為100～300 mg)及NH2-PSA(一般為100～300 mg)用量，分別作為因素A、B、C，每個(gè)因素取三個(gè)水平，按照L9(33)正交表試驗(yàn)，比較20 μg/kg加標(biāo)濃度水平下各因素組合的回收率和凈化效果，選擇最佳配比組合。正交試驗(yàn)因素見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，使用1 000 mg無水Na2SO4、200 mg C18-N以及300 mg NH2-PSA組成的凈化劑可以獲得最佳的凈化效果。

油脂和色素是火鍋底料主要的基質(zhì)干擾物質(zhì)，本文首先使用通過式固相萃取技術(shù)，對提取液進(jìn)行初步凈化，除去部分油脂和色素，再利用分散固相萃取技術(shù)，將初步凈化液用含一定比例的無水Na2SO4、C18-N及NH2-PSA組成的凈化劑進(jìn)行進(jìn)一步凈化處理，以吸附剩余的油脂和色素。通過將分散固相萃取技術(shù)與通過式固相萃取技術(shù)相結(jié)合的方式對油脂和色素含量高的火鍋底料進(jìn)行復(fù)合式凈化。此方式不僅有效凈化樣品溶液，而且顯著提高了樣品分析的通量。此外，本文對通過Oasis PRiME HLB固相萃取柱的最佳的乙腈比例進(jìn)行研究，分別考察75%、80%、85%三種乙腈比例對20 μg/kg加標(biāo)濃度水平下的基質(zhì)效應(yīng)的影響(回收率)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈的比例為80%時(shí)，5種目標(biāo)化合物提取效率最高，基質(zhì)效應(yīng)最低(圖2)。

表2 無水Na2SO4、C18-N及NH2-PSA用量配比的正交試驗(yàn)因素水平

圖2 不同乙腈濃度時(shí)5種罌粟殼生物堿(加標(biāo)濃度為20 μg/kg)的回收率Fig.2 Recoveries of 5 alkaloids from pericarpium papaveris(spiked with 20 μg/kg)with different acetonitrile concentrations

本文通過基質(zhì)效應(yīng)來評價(jià)采用的分散固相萃取技術(shù)結(jié)合通過式固相萃取技術(shù)的復(fù)合式凈化效率?；|(zhì)效應(yīng)用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比進(jìn)行評估，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線配置如下：分別取6份空白樣品2.0 g(檢測結(jié)果為陰性的火鍋底料)于50 mL聚丙烯離心管中，分別精密加入混合對照品儲(chǔ)備溶液(濃度為1.00 mg/L)適當(dāng)體積，按“1.3”制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制成最終濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，按“1.4”條件進(jìn)行分析，得到以火鍋底料為基質(zhì)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的百分比進(jìn)行評估。一般情況下，基質(zhì)效應(yīng)在85%～115%之間不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，本文結(jié)果基質(zhì)效應(yīng)范圍在91.5%～98.3%之間。所以本方法較好的消除了基質(zhì)效應(yīng)，有效的保證了定性、定量結(jié)果的準(zhǔn)備、可靠。

2.4 線性關(guān)系、定量限以及重復(fù)性

取“1.3”中已配制的標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，分別進(jìn)樣1 μL，以定量監(jiān)測離子對的離子流中色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表3。5種罌粟殼生物堿在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2均大于0.9954)。取空白樣品2.0 g(檢測結(jié)果為陰性的火鍋底料)，加入適當(dāng)稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.4”制備供試品溶液，得信噪比為3和10時(shí)分別為5種罌粟殼生物堿的檢測限(LOD)與定量限(LOQ)，結(jié)果見表3。

表3 5種罌粟殼生物堿的線性范圍、回歸方程、檢測限和定量限

2.5 方法回收率與精密度

取空白樣品(檢測結(jié)果為陰性的火鍋底料)，每份稱取樣品2.0 g，分別加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使供試品溶液最終加樣濃度分別為低、中、高3個(gè)水平(其中那可丁、罌粟堿和蒂巴因加標(biāo)濃度分別約為1、20、100 μg/kg，嗎啡和可待因的加標(biāo)濃度分別約為20、100、200 μg/kg)，平行6份，按樣品制備方法制備供試品溶液，檢測含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。5種罌粟殼生物堿的三個(gè)濃度水平的平均回收率為82.5%～95.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為(RSD)為3.4%～8.6%。

表4 火鍋底料中5種罌粟殼生物堿的回收率與精密度試驗(yàn)(n=6)

2.6 實(shí)際樣品檢測

利用本文建立的優(yōu)化后的前處理和色譜-質(zhì)譜條件，完成了2017年度國家食品藥品監(jiān)督抽驗(yàn)計(jì)劃(火鍋底料專項(xiàng))。結(jié)果顯示，40批次的火鍋底料均未檢出5種罌粟殼生物堿成分。

3 結(jié)語

本研究建立了分散固相萃取，結(jié)合通過式固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中5種罌粟殼生物堿的分析方法，優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件以及提取和凈化條件。該方法無需太復(fù)雜的樣品前處理?xiàng)l件，經(jīng)80%乙腈溶液提取，先用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行初步凈化，再使用1 000 mg無水Na2SO4、300 mg C18-N以及300 mg NH2-PSA組成的凈化劑進(jìn)一步凈化處理，樣品提取液經(jīng)復(fù)合式凈化后，有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了分析方法的選擇性和靈敏度。