基于UPLC特征圖譜和QAMS對(duì)懷牛膝藥材質(zhì)量控制的應(yīng)用研究

康 浩，孫亮亮，姚應(yīng)水

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 a.藥物化學(xué)與藥物分析教研室；b.醫(yī)療系，安徽 蕪湖 241003；2.皖南醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 慢性病防制研究所，安徽 蕪湖 241002)

懷牛膝主產(chǎn)于河南焦作境內(nèi)，是臨床上常用的“四大懷藥”之一[1]，屬莧科植物牛膝(AchyranthesbidentataBl.)，藥用其干燥根，具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效[2]，研究表明上述功效與其含有的多種活性成分杯莧甾酮、β-蛻皮甾酮及齊墩果酸型三萜皂苷等有關(guān)[3]。

目前對(duì)懷牛膝質(zhì)量控制評(píng)價(jià)的研究方法主要有兩大類：一類[4-5]是利用特征圖譜法對(duì)其化學(xué)成分整體模糊信息的反映，另一類[6-8]是對(duì)其活性成分含量的精確測(cè)定。因懷牛膝活性成分較多，相關(guān)對(duì)照品難以制備，且制備成本較高等因素影響，2020版《中華人民共和國(guó)藥典》只收載了易制備對(duì)照品的活性成分β-蛻皮甾酮含量測(cè)定[2]來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量，但并不能全面科學(xué)地進(jìn)行控制與評(píng)價(jià)。一測(cè)多評(píng)法(quantitative analysis of multi-components by single-marker,QAMS)是指以樣品中某一典型組分為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子(relative correction factor,RCF)，通過(guò)RCF計(jì)算其他組分的含量，適用于對(duì)照品難得或制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類多成分的同時(shí)測(cè)定[9-10]。如將超高效液相(ultra performance liquid chromatography,UPLC)特征圖譜和QAMS相結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，能為更全面科學(xué)的評(píng)價(jià)中藥材懷牛膝的質(zhì)量提供技術(shù)支撐[9，11]。

本實(shí)驗(yàn)研究建立的基于UPLC特征圖譜和QAMS相結(jié)合的方法，對(duì)懷牛膝中5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮和β-蛻皮甾酮3種成分進(jìn)行標(biāo)定的同時(shí)還能對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了采用易制備的β-蛻皮甾酮一個(gè)對(duì)照品即能完成其他多個(gè)成分的含量測(cè)定，為全面有效地控制中藥材懷牛膝的質(zhì)量提供科學(xué)有效、簡(jiǎn)便的技術(shù)手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 超高效液相譜儀(Wasters ACQUITY H-CLASS UPLCTM，四元高壓泵系統(tǒng)，在線脫氣系統(tǒng)，TUV 檢測(cè)器，Empower 2 工作站,Waters 公司)，KQ-200KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；ME 204型電子天平：博特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DZF-6090型真空干燥箱：上海精其儀器有限公司。乙腈：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；甲酸：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；屈臣氏蒸餾水；重蒸水(自制)。

1.2 試藥 懷牛膝藥材共10批(S1～S10，藥材來(lái)源見表1)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系趙寶林教授鑒定為正品。β-蛻皮甾酮對(duì)照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)180908，純度98.80%)，杯莧甾酮對(duì)照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)190218，純度99.35%)，5-羥甲基糠醛(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)190315，純度98.64%)。

表1 不同產(chǎn)地批次的懷牛膝藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 超高效液相色譜儀(Waters ACQUITY H-CLASS UPLCTM，四元高壓泵系統(tǒng)，在線脫氣系統(tǒng)，TUV 檢測(cè)器，Empower 2 工作站,Waters 公司)，Waters BEH C18(1.7 μm,2.1 mm × 100 mm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～1 min,90% B;1～2 min,90% →70 % B;2～5 min,70 % B;5～6 min,70% → 68% B;6～8 min,68% B;8～9 min,68 % → 62% B;9～12 min,62% B)，柱溫30 °C，流速 0.2 mL/ min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量為1 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品β-蛻皮甾酮7.52 mg置于1 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，充分搖勻，靜置備用；精密稱取對(duì)照品杯莧甾酮1.56 mg和5-羥甲基糠醛5.06 mg分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，充分搖勻，靜置備用。精密量取上述靜置備用溶液β-蛻皮甾酮0.5 mL、杯莧甾酮和5-羥甲基糠醛溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，充分搖勻，靜置備用。將上述4種溶液置于4℃冰箱中保存，備用。

2.1.3 供試品溶液 精密稱取過(guò)四號(hào)篩的懷牛膝藥材粉末1.0 g，置于有活塞的錐形瓶中，加甲醇與水的混合溶液(1∶1)10 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻置室溫重新稱重，用甲醇補(bǔ)足到原重量，充分搖勻，至高速離心機(jī)中于4℃下，以12 000 r/min離心30 min后，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液備用。

圖1 10批懷牛膝UPLC特征特征圖譜

A.懷牛膝藥材樣品共有峰模式特征圖譜；B.β-蛻皮甾酮、杯莧甾酮、5-羥甲基糠醛3種成分混合對(duì)照品圖譜，2為5-羥甲基糠醛；4為β-蛻皮甾酮；7為杯莧甾酮。

2.1.5 懷牛膝樣品特征圖譜相似度分析 利用“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件2012版”(國(guó)家藥典委員會(huì))[12]對(duì)10批懷牛膝樣品(S1～S10)的特征圖譜相似度進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明相似度均>0.920，具體情況見表2。

表2 10批懷牛膝藥材特征圖譜與對(duì)照特征圖譜的相似度

2.2 QAMS法測(cè)定懷牛膝中的5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮和β-蛻皮甾酮3種成分

2.2.1 線性關(guān)系 精密量取上述β-蛻皮甾酮、杯莧甾酮和5-羥甲基糠醛3種成分的對(duì)照品溶液,分別取樣1、2、4、8、10、12μL,每個(gè)濃度測(cè)定3次，取平均值。以對(duì)照品濃度 (mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以偏最小二乘法計(jì)算回歸方程。具體情況見表3。

表3 3種懷牛膝藥材成分的回歸方程及線性范圍

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的懷牛膝1號(hào)樣品粉末，精密稱定，約0.50 g。分別精密稱取相當(dāng)于0.50 g 樣品含量的對(duì)照品加入樣品粉末中,按2.1.3“供試品溶液”項(xiàng)下的制備方法制備，采用上述建立的UPLC特征圖譜法進(jìn)樣分析并計(jì)算,結(jié)果(見表4)顯示：β-蛻皮甾酮、杯莧甾酮、5-羥甲基糠醛的平均加樣回收率分別為 99.14 %、101.20 %、97.44 %，RSD 值分別為1.82 %、2.30 %、2.06 %，該方法的準(zhǔn)確度較高。

表4 懷牛膝藥材中待測(cè)成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 懷牛膝中5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮、β-蛻皮甾酮3種待測(cè)成分的RCF考察 根據(jù)RCF計(jì)算公式可得(Ws×Ai)/As= fs/i×Wi，公式中的As代表內(nèi)參物峰面積，Ws代表內(nèi)參物質(zhì)量，Ai代表被測(cè)組分i峰面積，Wi代表被測(cè)組分i質(zhì)量[13]，Wi對(duì)(Ws×Ai)/ As作回歸曲線分析，斜率即RCF。本研究團(tuán)隊(duì)以懷牛膝中的主要活性成分β-蛻皮甾酮作內(nèi)參物(s)，對(duì)6個(gè)質(zhì)量點(diǎn)在線性關(guān)系考察項(xiàng)下經(jīng)行測(cè)定，分別計(jì)算懷牛膝中杯莧甾酮(i1)、5-羥甲基糠醛(i2)與β-蛻皮甾酮(s)作內(nèi)參物的fs/i1、fs/i2為0.7843、0.8136。

2.2.7 UPLC-QAMS法的耐用性評(píng)價(jià) 色譜柱、流速、柱溫等3個(gè)方面可能是影響懷牛膝中5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮、β-蛻皮甾酮3種成分RCF耐用性的主要因素，本實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)考察了3種成分在2種不同型號(hào)的色譜柱(Waters BEH C18和WatersHSS T3)、3種不同流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)和不同柱溫 (25 °C、30 °C、35 °C)條件下對(duì)fs/i的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見表5)，在2種不同型號(hào)的色譜柱條件下，5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮與β-蛻皮甾酮之間的RCF的RSD值為1.1%～5.0%；在同種型號(hào)的色譜柱和不同流速條件下，5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮與β-蛻皮甾酮之間的RCF的RSD分別為3.17%、3.53%、1.29% 和2.27%、0.79%、0.75%；在同種型號(hào)的色譜柱和不同柱溫條件下，5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮與β-蛻皮甾酮之間的RCF的RSD值分別為3.37%、1.33%、3.36% 和 0.97%、1.93%、1.11%；說(shuō)明在上述3種有可能影響各成分RCF的重現(xiàn)性良好。

表5 不同色譜柱、不同流速、不同柱溫測(cè)定相對(duì)校正因子

2.2.8 懷牛膝中5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮、β-蛻皮甾酮3種待測(cè)組分色譜峰的定位 本實(shí)驗(yàn)研究主要采用待測(cè)成分(i)、內(nèi)參物(s)之間的相對(duì)保留時(shí)間差(ris=tRi/tRs)和保留時(shí)間差(ΔtRis = tRi-tRs)2個(gè)參數(shù)，對(duì)懷牛膝中的待測(cè)組分色譜峰進(jìn)行定位。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示(見表6)：ris值的波動(dòng)在3種不同條件之間波動(dòng)不明顯，懷牛膝中β-蛻皮甾酮(s)、杯莧甾酮(i1)、5-羥甲基糠醛(i2)3中成分ris值的RSD值為0.28%～5.57%，說(shuō)明上述方法對(duì)懷牛膝中3種待測(cè)組分色譜峰的定位是有效的、可行的、科學(xué)的。

表6 不同色譜柱、不同流速、不同柱溫測(cè)定的相對(duì)保留值和保留時(shí)間差值

2.2.9 UPLC-QAMS 法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 采用上述所建立的UPLC-QAMS法，以測(cè)得的β-蛻皮甾酮為內(nèi)參物(s)，對(duì)10批懷牛膝藥材中的杯莧甾酮(i1)和5-羥甲基糠醛(i2)的含量進(jìn)行測(cè)定；另采用外標(biāo)法對(duì)同批樣品成分含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見表7)：UPLC-QAMS 法與外標(biāo)法方法測(cè)定的結(jié)果無(wú)明顯差異，RSD值均<4%。

表7 一測(cè)多評(píng)與外標(biāo)法測(cè)定10批懷牛膝中3種成分含量 mg/g

3 討論

3.1 懷牛膝藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)意義 懷牛膝中含有甾酮類、皂苷類、多糖類以及微量元素等多種成分，其中甾酮類是其發(fā)揮藥理活性的主要成分[3]，而2020年版《中國(guó)藥典》[2]關(guān)于牛膝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收載了β-蛻皮甾酮一個(gè)指標(biāo)性成分，本文在此基礎(chǔ)上增加了杯莧甾酮、5-羥甲基糠醛2個(gè)指標(biāo)性成分?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明其中的杯莧甾酮具有促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖作用[8]，與懷牛膝臨床上的補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨作用相吻合；懷牛膝在貯藏過(guò)程中容易泛糖變色，藥用活性降低，劉振麗等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)泛糖變成黑色懷牛膝中的5-羥甲基糠醛的含量高達(dá)正常懷牛膝含量的10倍。因此，增加杯莧甾酮、5-羥甲基糠醛2個(gè)指標(biāo)性成分有益于對(duì)其品質(zhì)評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制。

3.2 懷牛膝藥材中QAMS定量檢測(cè)參照成分的選擇 β-蛻皮甾酮是2020版《中華人民共和國(guó)藥典》控制牛膝質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)性成分，高純度的對(duì)照品易得到，與外標(biāo)法相比的比值在(97.83±0.71)%～(98.28±0.50)%，且計(jì)算其他成分的準(zhǔn)確度又高，故本實(shí)驗(yàn)首選β-蛻皮甾酮作為懷牛膝藥材中QAMS定量檢測(cè)的參照成分。在缺少其他對(duì)照品的情況下，采用本文提供的相對(duì)校正因子及定位方法可以很好的實(shí)現(xiàn)利用一個(gè)對(duì)照品完成多個(gè)成分的含量測(cè)定。

3.3 采用相對(duì)保留值可對(duì)色譜峰準(zhǔn)確定位 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，針對(duì)同一超高效液相色譜系統(tǒng)和同一品牌色譜柱，應(yīng)用不同流速后，5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮與β-蛻皮甾酮之間的相對(duì)保留值時(shí)間差的RSD分別為1.21%、0.98%、1.39% 和 0.95%、0.73%、1.05%；應(yīng)用不同柱溫后，5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮與β-蛻皮甾酮之間的相對(duì)保留時(shí)間差的RSD值分別為1.26%、0.96%、0.59% 和 1.53%、1.02%、0.05%；應(yīng)用不同色譜柱時(shí)，5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮與β-蛻皮甾酮之間的相對(duì)保留時(shí)間差的RSD值分別為0.87%、0.95%和0.73%、0.92%，表明在此影響因素下各成分相對(duì)保留值的重現(xiàn)性良好；通過(guò)對(duì)色譜峰的定位研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所選參照峰的位置較為居中時(shí)，對(duì)另外2個(gè)組分峰的定位較為準(zhǔn)確。因此，本文采用相對(duì)保留值可對(duì)色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。

本實(shí)驗(yàn)研究建立的方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)懷牛膝中的5-羥甲基糠醛、杯莧甾酮和β-蛻皮甾酮3種成分同步進(jìn)行定性與定量研究，其測(cè)定計(jì)算的結(jié)果與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值無(wú)明顯差異，重現(xiàn)性良好，簡(jiǎn)便省時(shí)，能科學(xué)有效的反應(yīng)懷牛膝中其他有效活性成分的情況，提高了懷牛膝藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的水平。