二烯丙基硫醚對(duì)睡眠剝奪大鼠認(rèn)知功能的影響

朱 靜，張雙雙，張芯悅，李光建，查盈盈，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

睡眠剝奪(sleep deprivation,SD)是指因外界環(huán)境或自身的原因缺失了機(jī)體所需要的睡眠量的過程和狀態(tài)[1-2]。持續(xù)的SD會(huì)對(duì)機(jī)體組織造成嚴(yán)重的損傷，如神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、免疫防御功能下降、心臟疾病等，嚴(yán)重者甚至可引起死亡，直接威脅到人們的生命健康[3]。近年來的研究顯示，SD后導(dǎo)致的自由基產(chǎn)生增多、細(xì)胞抗氧化能力下降以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這3條途徑所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是SD后誘發(fā)機(jī)體損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。缺乏高質(zhì)量的睡眠會(huì)影響大腦實(shí)質(zhì)中神經(jīng)毒性代謝物的清除，增加氧化應(yīng)激，此外也有研究表明睡眠不足會(huì)降低某些抗氧化酶的表達(dá)[6]，增加體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物丙二醇(malonaldehyde,MDA)的產(chǎn)生,對(duì)機(jī)體造成損傷[7]。研究已知，細(xì)胞抵抗氧化損傷的機(jī)制之一是通過增加抗氧化反應(yīng)原件ARE基因的轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄因子核因子Nrf2可以通過與ARE結(jié)合發(fā)揮作用[8-10]。二烯丙基硫醚(diallyl sulfide,DAS)是草本植物大蒜中提取的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗血小板聚集、清除自由基、降血脂及預(yù)防心血管疾病等作用[11]。DAS的腦保護(hù)機(jī)制可能與其增強(qiáng)大鼠腦組織抗氧化酶活性，激活細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激通路相關(guān)[11]。

因此DAS可能會(huì)通過降低氧化應(yīng)激水平對(duì)SD引起的腦損傷有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)則運(yùn)用DAS提前干預(yù)SD模型大鼠，觀察其對(duì)SD大鼠認(rèn)知功能的影響及相應(yīng)機(jī)制的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)別(230±10)g成年雄性SD大鼠40只，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供，許可證號(hào) SCXK (蘇)2017-0001，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵照中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

1.2 儀器和藥品 50 cm×45 cm×45 cm曠場箱(Panlab，USA)、光輻射熱測痛儀(ZH-YLS-12A,安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，高速離心機(jī)(北京博勱行儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(美國BioTek公司，型號(hào)EPOCH2)，DAS(合肥拜爾迪化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：E1624032)，BCA蛋白濃度測定、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，生理鹽水(批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H34023608)，烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161208)，75%濃度醫(yī)用酒精等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物干預(yù) 于造模4 d前開始預(yù)防性干預(yù)

治療，DAS組及DAS+SD組大鼠每天進(jìn)行固定時(shí)間腹腔注射給藥DAS(200 mg/kg，溶解于二甲基亞砜)，共給藥7 d，另兩組大鼠腹腔注射相同劑量二甲基亞砜對(duì)照。

1.3.2 造模 采用改良多平臺(tái)法(modified multiple platform method,MMPM)[12]建立大鼠SD模型。把SD大鼠放到小平臺(tái)上，大鼠進(jìn)入睡眠后，由于肌張力降低而接觸水或掉到水中，突然驚醒而致SD；在水箱中裝入干凈的清水，使水面低于平臺(tái)約 1 cm，箱頂蓋上大小合適的鼠籠蓋，放置飼料和水瓶，大鼠均可在平臺(tái)間自由活動(dòng)，隨意進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)連續(xù)SD 3 d，期間對(duì)大鼠一般情況、體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測并對(duì)動(dòng)物的毛皮整潔度、光亮度、飲食、體質(zhì)量、精神狀態(tài)、攻擊行為等狀態(tài)進(jìn)行觀測。

1.3.3 曠場實(shí)驗(yàn) SD后立即進(jìn)行曠場試驗(yàn)[13]，分析大鼠的水平穿格次數(shù)及中央?yún)^(qū)停留時(shí)間，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將每只大鼠放入大小為50 cm×45 cm×45 cm的曠場箱中心，持續(xù)記錄5 min，然后取出大鼠，在放入下組大鼠前將箱底及四壁清理干凈，并用75%濃度的酒精去除其殘留的氣味，實(shí)驗(yàn)期間保持安靜，各組大鼠交替測試。

1.3.4 光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測 用光輻射熱測痛儀，對(duì)大鼠進(jìn)行不同光照強(qiáng)度下甩尾反應(yīng)潛伏期(tail flick latency，TFL)的移位法測定[14]，即首次在距鼠尾根部1 cm處，隨后每隔0.5 cm依次后移光照位點(diǎn)，進(jìn)行5個(gè)光照強(qiáng)度的檢測，設(shè)定光輻射熱測痛儀的光照強(qiáng)度(Focus值)為23、31、39、49、61，隨后依次測定各大鼠在不同光強(qiáng)下的TFL。將4組大鼠的TFL隨光刺激強(qiáng)度增強(qiáng)而縮短的結(jié)果采用數(shù)學(xué)模型擬合成曲線，即為甩尾反應(yīng)的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(timed dose-response relationship，TDRR)。

1.3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)生化檢測[13]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每只鼠根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射20%濃度的烏拉坦(7.5 ml/kg)將其麻醉，用生理鹽水灌流，取下大鼠腦部，在冰上剝離出海馬，冰浴研磨勻漿、離心取上清，采用丙二醛檢測試劑盒(TBA比色法)及酶標(biāo)比色法測定出樣品吸光度(optical density，OD)，計(jì)算出各組海馬MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 曠場實(shí)驗(yàn) 各組大鼠的軌跡示意圖以及曠場穿格次數(shù)與中央?yún)^(qū)停留時(shí)間進(jìn)行組間對(duì)比如圖1，單因素分析顯示SD組的曠場穿格次數(shù)及中央?yún)^(qū)停留時(shí)間[(58.67±17.81)次,(1.34±1.08)min]多于Control組[(43.60±8.87)次,(0.37±0.45)min](P<0.05)；而DAS+SD組各項(xiàng)指標(biāo)[(37.25±18.093)次,(0.33±0.21)min](P<0.05)顯著下降。

Control組與SD組比較：*P<0.05;DAS+SD組與SD組比較：#P<0.05;穿格次數(shù):F組間=5.348,P組間<0.01;中央格停留時(shí)間:F組間=5.712,P組間<0.01。

2.2 光輻射熱痛實(shí)驗(yàn) 4組大鼠的TFL均呈現(xiàn)隨光刺激強(qiáng)度增強(qiáng)而縮短的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(P<0.05)，其中SD組大鼠的TDRR曲線較Control組左移(P<0.05)，DAS+SD組較SD組右移(P<0.05)。并在光強(qiáng)度23、31、61時(shí)SD組的TFL較Control組縮短(P<0.05)，DAS+SD組較SD組延長(P<0.05)，如圖2。

采用雙曲線TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b進(jìn)行曲線擬合，顯示4組大鼠光強(qiáng)與甩尾反射潛伏期的關(guān)系。Control組,n=10;SD組,n=8;DAS組,n=9;DAS + SD組,n=9;雙因素方差分析(重復(fù)測量):P<0.05,各組大鼠甩尾潛伏期隨光照強(qiáng)度的變化；*P<0.01(SD組與Control組比較),#P<0.01(SD組與DAS+SD組比較)；F光強(qiáng)度=1936.169,P光強(qiáng)度<0.01；F光強(qiáng)度×組間=2.257,P光強(qiáng)度×組間<0.05；F組間=4.852,P組間<0.01。

2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)生化檢測 海馬區(qū)MDA含量檢測顯示如圖3，SD組大鼠MDA含量[(23.57±5.68)μmol/mg]較Control組[(18.99±2.72)μmol/mg]增加(P<0.05)，DAS+SD組[(18.04±5.53)μmol/mg]較SD組減少(P<0.05)。

SD組與Control組比較：*P<0.05;DAS+SD組與SD組比較：#P<0.05;F組間=3.586,P組間<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)過程中觀察到SD組大鼠活動(dòng)性明顯提高，出現(xiàn)易激惹、攻擊行為，最后呈現(xiàn)出精神萎靡等一般情況。通過自發(fā)探索性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SD組大鼠穿格次數(shù)與中央格停留時(shí)間較Control組顯著增加，表現(xiàn)為SD組大鼠異常興奮性與探索性行為增強(qiáng)，與其他學(xué)者研究相一致[15]，而DAS+SD組指標(biāo)有所下降，表現(xiàn)為DAS用藥干預(yù)SD使大鼠異常興奮性降低。通過痛覺檢測實(shí)驗(yàn)，SD組大鼠熱輻射痛TFL較Control組顯著下降，表現(xiàn)為睡眠不足導(dǎo)致大鼠痛覺過敏，與其他研究結(jié)論相一致[16]，DAS+SD組大鼠的熱輻射痛TFL較SD組升高，與Control組相似，表現(xiàn)為DAS干預(yù)可一定程度上改善SD大鼠的痛覺敏化。通過檢測大鼠自發(fā)探索性及痛覺變化等與認(rèn)知相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，顯示DAS干預(yù)對(duì)SD大鼠認(rèn)知功能損害有改善作用。

SD組大鼠海馬區(qū)MDA含量較其他各組增多，提示SD大鼠海馬區(qū)產(chǎn)生了一定程度的氧化應(yīng)激，與其他研究相一致[17]，與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果DAS+SD組MDA含量較SD組減少，提示DAS干預(yù)對(duì)SD大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激損傷有緩解作用。綜合以上，DAS干預(yù)可降低SD大鼠氧化應(yīng)激水平。

綜合所述，本實(shí)驗(yàn)通過DAS預(yù)先干預(yù)SD大鼠并結(jié)合一系列認(rèn)知相關(guān)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制的研究，表明了DAS可能通過降低氧化應(yīng)激水平從而改善SD產(chǎn)生的認(rèn)知功能損害。但是目前對(duì)DAS的作用機(jī)制研究的并不是很清楚，本實(shí)驗(yàn)僅初步對(duì)DAS有一定的探索和發(fā)現(xiàn)，但仍未從藥物作用的分子機(jī)制及其內(nèi)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面展開進(jìn)一步的探索，且相關(guān)實(shí)驗(yàn)中提示DAS可能的作用通路Nrf2/NQO1通路[12]，是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的主要通路，可用于后期進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探討。