IRE1對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠淋巴細(xì)胞凋亡的作用研究

宋嗣恩，覃月秋，黃贊松，周喜漢

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化內(nèi)科常見(jiàn)的急危重癥，約占急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)20%，該病起病兇險(xiǎn)、并發(fā)癥多、治療費(fèi)用高、預(yù)后差、病死率高[1-2]。臨床上SAP的早期表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，晚期常因繼發(fā)感染導(dǎo)致多器官功能障礙(multiple organ dysfunction，MODS)。有研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡是SAP患者繼發(fā)感染及膿毒癥的重要原因[3]，但其分子機(jī)制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[4]，而IRE1是否參與SAP淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)文獻(xiàn)報(bào)道較少。為明確IRE1在大鼠SAP淋巴細(xì)胞凋亡中的作用，本研究應(yīng)用逆行胰膽管注射?；悄懰徕c誘導(dǎo)SD大鼠SAP動(dòng)物模型，RT-qPCR檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞IRE1 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡，初步探討IRE1對(duì)SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的作用，為闡明SAP機(jī)體免疫失衡機(jī)制，尋找干預(yù)和治療SAP新靶點(diǎn)，提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 20只體重控制在250～300 g的成年SD大鼠，?；悄懰徕c(美國(guó)Sigma)；大鼠淀粉酶和脂肪酶測(cè)定試劑盒(北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司) ；總RNA提取試劑盒(上海閃晶分子生物科技有限公司)；Fastking RT Kit(上海閃晶分子生物科技有限公司)； SYBR Green(上海閃晶分子生物科技有限公司)；PCR引物IRE1、 Caspase-3合成(上海捷倍思基因技術(shù)有限公司)；Anti- IRE1抗體、Anti-Caspase-3抗體(默克生命科學(xué))；紫外分光光度計(jì)；羅氏LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、SAP組，每組10只。SO組大鼠僅開(kāi)腹翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹，SAP組大鼠在胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g構(gòu)建SAP模型[5]。

1.2.2 胰腺組織病理學(xué)及評(píng)分 按照Schmidt評(píng)分細(xì)則及方法[6]，胰腺組織石蠟包埋，超薄切片機(jī)切成4微米/片，HE染色后，采用雙盲法，轉(zhuǎn)顯微鏡下由兩名病理醫(yī)生進(jìn)行閱片評(píng)分，隨機(jī)選取5個(gè)400×視野/片，進(jìn)行觀察以下4種病理狀態(tài)：①水腫(edema)；②出血(hemorrhage)；③壞死(necrosis)；④炎癥浸潤(rùn)(inflammatory infiltration)，這4種病理狀態(tài)作為病理?yè)p傷嚴(yán)重程度評(píng)分的參考依據(jù)，逐一進(jìn)行評(píng)分，并做好記錄。

1.2.3 淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)方法 按照大鼠淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 脾臟淋巴細(xì)胞分離 研磨脾臟組織，制備脾臟組織單細(xì)胞懸液，加1×PBS或1640無(wú)血清培養(yǎng)液3 ml按照1∶1 比例稀釋；混勻，37℃水浴中平衡，吸取脾臟組織單細(xì)胞懸液至淋巴細(xì)胞分離液液面上，置于20℃，2000 r/min水平離心機(jī)離心20 min，吸取乳白色淋巴細(xì)胞層，加入15 ml離心管中，然后加入細(xì)胞洗滌液10 ml，混勻細(xì)胞，離心10 min(轉(zhuǎn)速1500 r/min)，倒掉上清液，重復(fù)操作本步驟一次。將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到平皿中， 5%CO2培養(yǎng)箱中設(shè)定溫度37℃，進(jìn)行培養(yǎng)60 min，待單核細(xì)胞貼壁后，收集所需的淋巴細(xì)胞懸液。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè) IRE1 mRNA、Caspase-3 mRNA表達(dá)內(nèi)參β-actin引物序列：F5′-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3′，R5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′。IRE1序列：F5′-GGACTGCCTGGGTCTTTGAT-3′，R5′-TGTGGGGTCAAACGCCTATT-3′。Caspase-3序列：F5′-CTAGCTCCTAGTCTCTGCTCCC-3′，R5′-TCCGTCCCCAATACGTGTCGAATGCA-3′。按照操作說(shuō)明書(shū)，分別提取各組脾臟組織的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260、OD280其濃度。抽取2 μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，將其存入-80℃冰箱。采用SYBR Green擴(kuò)增cDNA，并使用PCR儀檢測(cè)。以β-actin分析IRE1和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行對(duì)照，利用2-△△CT法計(jì)算IRE1及 Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡 分離好的淋巴細(xì)胞懸液，采用低溫PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞，細(xì)胞用1×Binding Buffer調(diào)為1×106/ml，吸取100 μl淋巴細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至5 ml流式管中，各加入5 μl PI 和5 μl AnnexinV-FITC，緩慢混勻細(xì)胞懸液，孵育(條件為：室溫25℃，避光15 min)，將400 μl 1×Binding Buffer加入每個(gè)流式管，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胰腺病理評(píng)分 SO組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯水腫，偶有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；SAP組胰腺腺泡高度水腫，出現(xiàn)腺泡結(jié)構(gòu)的破壞，可見(jiàn)間質(zhì)內(nèi)的紅細(xì)胞滲出和出血、壞死，血管損傷或血栓形成， 間質(zhì)水腫，間隔模糊變寬，炎癥反應(yīng)明顯，可見(jiàn)脂肪壞死，導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡細(xì)胞萎縮。按照Schmidt評(píng)分細(xì)則，SAP組與SO組比較，胰腺病理組織學(xué)評(píng)分顯著性增加，見(jiàn)表1。

表1 大鼠胰腺病理組織損傷評(píng)分

2.2 大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平 SAP組中大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平含量均顯著升高，與SO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平含量 單位：U/L

2.3 大鼠脾臟淋巴細(xì)胞IRE1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量 SO組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞中IRE1 、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈低表達(dá)，SAP組大鼠中IRE1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，與SO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：與SO組相比較，*：P<0.05。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡情況 使用二維散點(diǎn)圖表示大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率，以Annexin-V FITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)，以陰性對(duì)照、PI單染管和FITC單染管設(shè)定界限，把淋巴細(xì)胞分成：正?；罴?xì)胞(左下象限Q4，Annexin-V FITC-、PI-)；早期凋亡細(xì)胞(右下象限Q3，Annexin-V FITC+、PI-)；死亡細(xì)胞(右上象限Q2，Annexin-V FITC+、PI+)。SAP組脾淋巴細(xì)胞凋亡率與SO組比較，脾淋巴細(xì)胞凋亡率升高(P<0.001)，見(jiàn)表3、圖2。

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠脾血淋巴細(xì)胞凋亡率

2.5 SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞中IRE1與Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量相關(guān)分析 SAP組中脾臟淋巴細(xì)胞IRE1 mRNA與脾臟淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.884，P<0.05)，提示脾臟淋巴細(xì)胞IRE1 mRNA表達(dá)增高，脾臟淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA水平隨之上升，見(jiàn)圖3。

2.6 SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞中IRE1 mRNA表達(dá)與凋亡率的相關(guān)分析 SAP組中脾臟淋巴細(xì)胞IRE1 mRNA與脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.875，P<0.05)，顯示脾淋巴細(xì)胞中IRE1表達(dá)的增高，脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率升高，見(jiàn)圖4。

3 討論

SAP是由胰腺的局部炎癥引發(fā)嚴(yán)重的全身多器官損害的疾病，它主要以致命的MODS和SIRS為特征[7]。盡管臨床上大部分的SAP患者能夠得到及時(shí)診斷和必要的治療，但治療手段和方法的選擇仍然十分有限[8]。目前，SAP仍然是一個(gè)高發(fā)病率和死亡率的消化系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅在歐洲SAP患者死亡率甚至高達(dá)44%[9]。AP首先從無(wú)菌的局部炎癥開(kāi)始，誘發(fā)SIRS，然后是代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)，有相關(guān)研究表明在SAP小鼠中SIRS和CARS可并行發(fā)展[10]，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制。SAP初期始于胰腺組織的局部炎癥，可導(dǎo)致多種胰腺外器官功能障礙的發(fā)生，然而，潛在的機(jī)制仍不清楚[11]。研究表明淋巴細(xì)胞大量凋亡導(dǎo)致SAP患者淋巴細(xì)胞亞群減少，是影響機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制的重要因素[5，12]。我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP淋巴細(xì)胞凋亡率增高，與前人的研究結(jié)果一致[13-14]，提示機(jī)體免疫功能受損。

SO組

SAP組

圖3 SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞中IRE1與Caspase-3mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

圖4 SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞中IRE1與凋亡率的相關(guān)性

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是新近研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。細(xì)胞應(yīng)激是AP等胰腺疾病發(fā)生的先決條件，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生紊亂，且堆積著大量的錯(cuò)誤/未折疊蛋白質(zhì)，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)以保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。但持續(xù)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘發(fā)炎癥，嚴(yán)重時(shí)可致細(xì)胞凋亡，且與AP的細(xì)胞凋亡存在顯著關(guān)系[16]。越來(lái)越多的證據(jù)表明ERS是損傷胰腺腺泡細(xì)胞的早期反應(yīng)，是AP的發(fā)病機(jī)制之一[15]。

IRE1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)途徑，是啟動(dòng)的觸發(fā)UPR的最保守的途徑[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道AP通過(guò)IRE1通路激活胰腺的ERS，IRE1、 XBP1 mRNA和蛋白水平顯著升高[4]，而ERS可能通過(guò)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡導(dǎo)致實(shí)質(zhì)損傷[18]。IRE1α內(nèi)切酶是ERS的關(guān)鍵調(diào)控因子，控制著腫瘤細(xì)胞的存活和凋亡。抑制IRE1α內(nèi)切酶可導(dǎo)致剪接X(jué)BP1的減少，從而降低癌細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞的死亡[19]。通過(guò)抑制自適應(yīng)的UPR反應(yīng)信號(hào)通路，IRE1還激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，促進(jìn)細(xì)胞死亡和胰腺炎[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)SAP大鼠脾淋巴細(xì)胞IRE1表達(dá)明顯升高，提示SAP時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1途徑激活，IRE1可能參與SAP的發(fā)病，這與Jia G等[21]在其他動(dòng)物身上的研究結(jié)論相符，但是否與淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)尚不明確，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了脾淋巴細(xì)胞Caspase-3表達(dá)，并進(jìn)行了相關(guān)研究。

為明確IRE1與SAP淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系，我們做了IRE1與Caspase-3表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡率相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SAP組中脾臟淋巴細(xì)胞中IRE1 mRNA表達(dá)增高，同時(shí)脾臟淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA水平及淋巴細(xì)胞凋亡率亦升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，脾臟淋巴細(xì)胞IRE1 mRNA表達(dá)水平與Caspase-3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，IRE1 mRNA與淋巴細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)。綜合以上分析， IRE1高表達(dá)，有可能是在SAP中導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡增加的重要原因。淋巴細(xì)胞是一種重要的炎性細(xì)胞，其表達(dá)水平通常代表著炎癥水平的高低。在SO組中，淋巴細(xì)胞的比例低，凋亡水平低，正說(shuō)明了SO組中淋巴細(xì)胞處于一個(gè)良性的循環(huán)中。相反，淋巴細(xì)胞在SAP組中的高表達(dá)與高凋亡，說(shuō)明了淋巴細(xì)胞的生成與因抗炎所致的凋亡，處于一個(gè)高速的循環(huán)之中。由于淋巴細(xì)胞能分泌諸多炎性因子，炎性因子在SAP患者體內(nèi)的蓄積，可導(dǎo)致“炎癥風(fēng)暴”的產(chǎn)生，這是胰腺炎患者死亡最常見(jiàn)的原因之一[22-23]。因此通過(guò)調(diào)控IRE1的表達(dá)，干預(yù)淋巴細(xì)胞的凋亡，減少炎癥因子的釋放可能是SAP的一個(gè)新的治療思路。