漿水發(fā)酵中的優(yōu)勢乳酸菌分離鑒定

胡瑩瑩　趙麗　史力學　李全合

摘要：利用VITEK 2compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)對漿水發(fā)酵過程中乳酸菌種類及數(shù)量進行鑒定，結果表明，發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌有4株乳酸菌菌株和2株酵母菌菌株。4株乳酸菌菌株分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），其中優(yōu)勢菌群為發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌;2株酵母菌菌株分別為平常假絲酵母（Candida inconspicua）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）。漿水發(fā)酵中的優(yōu)勢乳酸菌為發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌。漿水發(fā)酵至第3～4 天時，植物乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，發(fā)酵乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，短乳桿菌為3.2×106～6.5×107 CFU/mL，乳酸片球菌為4.6×105～2.5×106 CFU/mL，此時漿水風味最佳。

關鍵詞：漿水;發(fā)酵優(yōu)勢菌群;乳酸菌;酵母菌;分離鑒定

中圖分類號：TS255.3 ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ?文章編號：1001-1463（2021）04-0043-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.04.011

Isolation and Identification of Dominant Lactic Acid Bacteria in Fermented Pickle Juice

HU Yingying， ZHAO Li， SHI Lixue， LI Quanhe

（Tianshui Food Inspection and Testing Center， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract：VITEK 2Compact automatic microbial identification system was used to identify the species and quantity of lactic acid bacteria in the pickle juice fermentation process. The results showed that there were 4 strains of lactic acid bacteria and 2 strains of yeast in the fermentation process. The four Lactobacillus strains were Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici， respectively， and the dominant bacteria were Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis. Two strains of yeast strains respectively Candida inconspicua and Candida rugosa. The dominant lactic acid bacteria in the fermentation of pickle juice were Lactobacillus fermentum and Lactobacillus brevis. At the 3rd to 4th day of fermentation， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici were 1.2×107～1.6 ×107 CFU/mL， 1.2×107～1.6 ×107 CFU/mL， 3.2×106～6.5×107 CFU/mL and 4.6×105～2.5×106 CFU/mL， respectively， indicating the best flavor of the pickle juice.

Key words：Pickle juice;Dominant population;Lactic acid bacteria;Yeast;Isolation and identification

發(fā)酵蔬菜是以各種蔬菜為原料，利用有益微生物的活動并且控制其一定的生長條件，對蔬菜進行發(fā)酵加工后制成的食品。發(fā)酵蔬菜主要有泡菜、酸菜、醬菜和腌菜等[1 - 2 ]。漿水是甘肅、陜西等我國西北地區(qū)民間廣泛流傳的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，一般以芹菜為原料，加入面湯和老漿水（俗稱“引子”）發(fā)酵而成。口味酸醇、清香，且其漿水營養(yǎng)豐富，具有調中引氣、開胃止渴、解煩去睡、調理臟腑、利小便和降血壓等功效[3 ]。傳統(tǒng)漿水發(fā)酵微生物菌系復雜，主要包括枯草芽孢桿菌、醋酸菌 、乳酸菌、酵母菌、霉菌等，其中優(yōu)勢菌群為乳酸菌和酵母菌，且乳酸菌多為厭氧或兼性厭氧菌株[3 - 6 ]。我們按照已有傳統(tǒng)工藝制作芹菜漿水，研究了漿水發(fā)酵中乳酸菌種類及其優(yōu)勢菌群、變化規(guī)律，以期對漿水工業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 供試材料

供試新鮮漿水、芹菜、面粉均為市售。

1.2 ? 儀器與設備

EX30生物顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），Bio II Advance二級生物安全柜（西班牙泰事達公司），XW-80A旋渦混合器（上海精科實業(yè)股份有限公司），MJ-350B霉菌培養(yǎng)箱、SPX-350B生化培養(yǎng)箱（上海瑯玕實驗設備有限公司），MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械株式會社），MGC厭氧培養(yǎng)盒（日本三菱化學株式會社中國有限公司），VITEK 2compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃股份有限公司）。

1.3 ? 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基，鑒定培養(yǎng)基為蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、明膠基礎培養(yǎng)基、V-P實驗培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基、含5%羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基、含5%羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。均購自北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.4 ? 試驗方法

1.4.1 ? ?漿水制作工藝 ? ?采用傳統(tǒng)工藝。將芹菜洗凈切成寸段，沸水熱燙3 min撈出，瀝水備用。用面粉、水按質量比1∶200煮制面湯，芹菜、面湯按質量比1∶4入缸，溫度降至30 ℃時按4%含量加入上述原漿水為引子，攪勻后進行發(fā)酵[7 ]。

1.4.2 ? ?芹菜漿水發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群的變化

漿水中優(yōu)勢菌有乳酸菌、酵母菌。采用平板計數(shù)法，在發(fā)酵當天起每天同時采樣，乳酸菌按GB4789.35 — 2016方法[8 ]、酵母菌按GB4789.15 — 2016方法測定其菌數(shù)[9 ]，記錄培養(yǎng)皿中各類菌落數(shù)目、優(yōu)勢菌等。具體培養(yǎng)條件詳見表1。

1.4.3 ? ?發(fā)酵過程中乳酸菌群的分離鑒定 ? ?①分離純化。在 MRS 培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基上，用接種環(huán)挑取生長形態(tài)不同，具有鈣圈的優(yōu)勢菌落于無菌生理鹽水中，濃度稀釋到×10-5、×10-7。涂布接種于分離培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng) 72 h 后挑取菌落豐厚，且占生長優(yōu)勢的單菌落反復純化，從不同發(fā)酵時期的漿水中分離出不同形態(tài)菌落，進行純化培養(yǎng)。將所獲菌株編號并保存?zhèn)溆?。②菌株初步鑒定。鏡檢菌落形態(tài)和菌體形態(tài)。③生理生化鑒定。將上述菌株連續(xù)活化2次，通過革蘭染色鏡檢，KOH試驗、過氧化氫酶試驗、H2S 試驗、V-P試驗、硝酸鹽、明膠液化、吲哚試驗、產(chǎn)葡聚糖試驗、碳水化合物發(fā)酵等試驗進行菌種鑒定[6， 8 ]。④儀器生化鑒定。用接種環(huán)挑取適量培養(yǎng)18～24 h的菌苔至3 mL 0.45%NaCl溶液中， 配成0.5～0.65 Mac單位的菌懸液，選用適合的VITEK鑒定卡，將卡上彎管插入配制好的菌懸液中， 置于VITEK 2compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行儀器自動讀卡鑒定。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 菌株分離和純化

經(jīng)幾代純化獲得6株菌株，其中由MRS上分得3株，分別記為L1、L2、L3;由MC上分得1株記為L4，由孟加拉紅上分得2株，分別記為Y1、Y2。

2.2 ? 菌株初步鑒定

分別對L1、L2、L3、L4、Y1、Y2等菌株在 MRS培養(yǎng)基 、MC培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上的菌落和菌體形態(tài)特征進行觀察的結果見表2、圖1。由表2和圖1看出，菌株Y1、Y2菌體為革蘭染色藍色，菌體較大，棒狀或橢圓狀，有芽殖等，初步判定為酵母菌，菌株L1、L2、L3、L4需進一步鑒定。

2.3 ? 生理生化鑒定

生理生化鑒定的結果（表3、表4）表明，菌株L1、L2、L3、L4 的KOH、H2O2、V-P、吲哚試驗均表現(xiàn)為陰性，但對碳水化合物的利用不同，根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》 （第八版）、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及乳酸細菌分類鑒定及試驗方法[10 - 11 ]，將菌株 L1、L2、L3、L4初步鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）;依據(jù)《酵母菌特性及鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》[12 - 13 ]，將分離菌株Y1、Y2初步鑒定為假絲酵母（Candida inconspicua、Candida inconspicua）。VITEK 2compact 微生物分析系統(tǒng)自動化程度高，較傳統(tǒng)生化鑒定試劑盒操作簡單，且耗時更短，快速高效，鑒定結果準確可靠。從表5可以看出，經(jīng)VITEK 2compact 鑒定，菌株L1為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株L2為 發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株L3為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），菌株L4為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），菌株Y1為平常假絲酵母（Candida inconspicua），菌株Y2為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），可見 VITEK 2compact 鑒定結果與生化鑒定結果基本吻合。

2.4 ? 漿水發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌群的變化

漿水發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌群生長變化情況見表6及圖2，酵母菌生長變化見圖3。由表6及圖2可見，漿水發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌群菌株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）以第4天數(shù)量最多，為1.6×107 CFU/mL;第3天次之，為1.2×107 CFU/mL，其余時間為8.5×105～9.0×106 CFU/mL。發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）以第2天最多，為5.0×108 CFU/mL;第3天次之，為1.3×108 CFU/mL;其余時間為5.4×106～1.4×107 CFU/mL。短乳桿菌（Lactobacillus brevis）以第3天最多，為6.5×107 CFU/mL;第2天次之，為4.6×107 CFU/mL;其余時間為2.5×105～1.9×107 CFU/mL。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）以第4天最多，為2.5×106 CFU/mL;第3天次之，為4.6×105 CFU/mL;其余時間為1.5×102～4.6×105 CFU/mL。菌株Y1為平常假絲酵母（Candida inconspicua），菌株Y2為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），二者均為假絲酵母，因此平常假絲酵母+皺褶假絲酵母以第6天、第7天最多，均為3.5×105 CFU/mL;第5天次之，為3.0×105 CFU/mL;其余時間為9.2×103～2.2×105 CFU/mL?？梢姡跐{水發(fā)酵初期（1～2 d）乳酸菌數(shù)量較少，產(chǎn)品沒有酸味，此時主要是需氧微生物枯草芽孢桿菌、醋酸菌、明串珠菌占優(yōu)勢[6 ]。2 d后乳酸菌數(shù)量開始增加，隨著酸度的降低成為優(yōu)勢菌群，活躍是在發(fā)酵中期（3～5 d），這與前人的研究基本一致[6 ]。此時發(fā)酵乳桿菌、希氏乳桿菌生長占優(yōu)勢，在發(fā)酵第3天達到峰值;隨著發(fā)酵的進行，屬于同型乳酸發(fā)酵的植物乳桿菌開始占優(yōu)勢并在第4天達到峰值。從計數(shù)上看，在乳酸菌活躍的整個發(fā)酵期，發(fā)酵乳桿菌和希氏乳桿菌在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢，乳酸片球菌在整個發(fā)酵過程中數(shù)量較少，不是優(yōu)勢菌群;發(fā)酵后期（第6～10天）乳酸菌數(shù)量減少，活力下降。由圖3可知，漿水發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量呈先增加后降低的趨勢，發(fā)酵前中期酵母菌生長受抑制，隨著乳酸菌活力的下降，從4 d后開始迅速生長;在發(fā)酵中后期（第5～7天）占優(yōu)勢，同時在第6～7天時酵母菌數(shù)量達到峰值。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵6 d后漿水開始有霉菌滋生，霉菌、酵母菌的數(shù)量逐漸增加，質量下降，風味不再酸香爽口。可見漿水在發(fā)酵第3～4天時達到最佳狀態(tài)，食用風味最佳。

3 ? 結論

經(jīng)鑒定及測定，發(fā)現(xiàn)漿水中乳酸菌群有植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌、乳酸片球菌等，其中優(yōu)勢菌群為發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌，酵母菌群有平常假絲酵母+皺褶假絲酵母。漿水發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌群菌株植物乳桿菌以第4天最多，為1.6×107 CFU/mL;第3天次之，為1.2×107 CFU/mL，其余時間為8.5×105～9.0×106 CFU/mL。發(fā)酵乳桿菌以第2天最多，為5.0×108 CFU/mL;第3天次之，為1.3×108 CFU/mL，其余時間為5.4×106～1.4×107 CFU/mL。短乳桿菌以第3天最多，為6.5×107 CFU/mL;第2天次之，為4.6×107 CFU/mL，其余時間為2.5×105～1.9×107 CFU/mL。乳酸片球菌以第4天最多，為2.5×106 CFU/mL;第3天次之，為4.6×105 CFU/mL，其余時間為1.5×102～4.6×105 CFU/mL。菌株Y1為平常假絲酵母，菌株Y2為皺褶假絲酵母，二者均為假絲酵母，因此平常假絲酵母+皺褶假絲酵母以第6天、第7天最多，均為3.5×105 CFU/mL;第5天次之，為3.0×105 CFU/mL，其余時間為9.2×103～2.2×105 CFU/mL。漿水發(fā)酵至第3～4天時，植物乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，發(fā)酵乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，短乳桿菌為3.2×106～6.5×107 CFU/mL，乳酸片球菌為4.6×105～2.5×106 CFU/mL，食用風味最佳，可直接食用或真空貯藏待售。

參考文獻：

[1] 施安輝，周 ? 波. ?蔬菜傳統(tǒng)腌制發(fā)酵工藝過程中微生物生態(tài)學的意義[J]. ?中國調味品，2002（5）：11-15.

[2] 楊榮玲，肖更生. ?我國蔬菜發(fā)酵加工研究進展[J]. ?保鮮與加工，2006（2）：15-18.

[3] 孟憲剛，周鴿鴿，張麗珂. ?發(fā)酵蔬菜漿水中優(yōu)勢好氧微生物的分離及鑒定[J]. ?食品工業(yè)科技，2010，32（3）：222-224.

[4] 張 ? 軼，王玉麗. ?傳統(tǒng)發(fā)酵食品—漿水中微生物的分離與初步鑒定[J]. ?食品科學，2007，28（1）：219-222.

[5] 張麗珂，周鴿鴿，孟憲剛. ?傳統(tǒng)發(fā)酵食品漿水中厭氧微生物分離鑒定初探[J]. ?食品科技，2010，35（4）：39-41.

[6] 何 ? 玲，李勤振. ?漿水芹菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群的分離、鑒定及變化[J]. ?食品科技，2010，35（5）：36-40.

[7] 何 ? 玲，楊公明. ?漿水芹菜自然和接種發(fā)酵過程中有機酸的變化[J]. ?北方園藝，2011（4）：179-181.

[8] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局. ?食品安全國家標準：食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗：GB4789.35 — 2016[S]. ?北京：中國標準出版社，2016.

[9] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準：食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)：GB4789.15 — 2016[S]. ?北京：中國標準出版社，2016.

[10] RE 布坎南，E 吉本斯. ?伯杰細菌鑒定手冊 [M]. ?中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組，譯. ?8版. ?北京：科學出版社，1984.

[11] 東秀珠，蔡妙英. ?常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. ?北京：科學出版社，2001.

[12] 巴尼特，佩 ? 恩，亞 ? 羅. ?酵母菌的特征與鑒定手冊[M]. ?青島：中國海洋大學出版社，1991：15-35.

[13] 魏景超. ?真菌鑒定手冊[M] . ?上海：上?？茖W技術出版社，1979：100-120.

（本文責編：鄭立龍）

收稿日期：2021 - 01 - 25;修訂日期：2021 - 03 - 01

基金項目：天水市科技支撐計劃項目（2020-SHFZKJK-4676）。

作者簡介：胡瑩瑩（1986 — ），女，甘肅天水人，工程師，碩士，主要從事食品微生物檢測工作。Email：289579020@qq.com。