清熱涼血方對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型JAKs/STATs通路表達(dá)影響的研究

齊瀟麗 ，李瑩 ，蔣俊青 ，白彥萍

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；2.山東省煤炭臨沂溫泉療養(yǎng)院，山東臨沂276032；3.中日友好醫(yī)院，北京100029）

銀屑病是一種T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、免疫反應(yīng)異常的慢性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑為主要臨床表現(xiàn)。目前銀屑病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)病灶內(nèi)異常浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎性因子是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，活化的信號(hào)通路在銀屑病的炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，目前研究表明酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAKs/STATs）、Notch、核因子（NF）-κB、細(xì)胞外因子（Wnt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中極為重要，其中，JAKs/STATs通路為近年來的研究熱點(diǎn)之一[1]?！扒鍩釠鲅健笔菍?dǎo)師白彥萍教授根據(jù)長(zhǎng)期的臨床經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)基礎(chǔ)理論、循證醫(yī)學(xué)及現(xiàn)代藥理學(xué)的指導(dǎo)下，以犀角地黃湯為底方加減完成的，有清熱涼血解毒之功效，是治療銀屑病血熱證的代表方。本課題組前期的隨機(jī)平行對(duì)照試驗(yàn)驗(yàn)證了清熱涼血方（祛銀顆粒）的有效性和安全性[2]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)建立銀屑病樣小鼠模型，并以不同濃度清熱涼血方干預(yù)，以雷公藤多苷作為陽性對(duì)照，進(jìn)而觀察清熱涼血方對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（SOCS1）和JAKs/STATs信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達(dá)水平的影響，以闡明清熱涼血方對(duì)銀屑病的療效機(jī)制，豐富銀屑病中醫(yī)辨治理論，為中藥治療銀屑病臨床和科研提供思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動(dòng)物 無特定病原體級(jí)（SPF）級(jí)BALB/c小鼠，雄性，8 周齡，體質(zhì)量 17～21g，48 只，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。于SPF 3級(jí)動(dòng)物房無菌飼料喂養(yǎng)。將咪喹莫特乳膏外涂于BALB/c小鼠背部備皮區(qū)，厚度為 1～2 mm，2 次/d，連續(xù) 8 d，構(gòu)建銀屑病樣小鼠模型。

1.1.2 主要試劑 清熱涼血方所含蛇莓、白英、土茯苓、白花蛇舌草、丹皮、生地、赤芍、紫草等購(gòu)自市售中藥房，按照成人劑量換算成小鼠劑量制備水煎劑；咪喹莫特乳膏（憂必青，珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，國(guó)藥準(zhǔn)字h20040283）；雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司）；SsoFast EvaGreen Supermix（1725201AP）、引物[英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司]、SV Total RNA Isolation System（Z3100）、ReverseTranscriptionSystem（A3500）、Bio-RADiScript cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Z3101）、Trizol溶液（諾華生物）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 將BALB/c小鼠背部去毛后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、清熱涼血方低、中、高濃度組及雷公藤多苷組（陽性藥物對(duì)照組），用無菌醫(yī)用棉簽將咪喹莫特乳膏均勻涂抹于模型組、清熱涼血方組及雷公藤多苷組小鼠背部備皮區(qū)域，厚度約為1～2 mm，充分涂抹以使藥物被皮膚充分吸收，2次/d，共8 d。與此同時(shí)，分別給予雷公藤多苷組、清熱涼血方各濃度組小鼠相應(yīng)溶液灌胃，每只0.1 mL/次，早晚各1次，連續(xù)8 d。各組小鼠每天拍照，進(jìn)行銀屑病樣皮損嚴(yán)重程度對(duì)比，第9天將所有小鼠頸椎脫臼處死后取背部皮膚，分別用于病理組織檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.2.1 皮損大體觀察 實(shí)驗(yàn)期間每天對(duì)小鼠進(jìn)行拍照。參考銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分，觀察小鼠靶皮損紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)增厚程度。

1.2.2.2 皮損病理改變 取各組小鼠背部皮膚，經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。4 μm厚連續(xù)切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠靶皮損組織學(xué)改變。

1.2.2.3 皮損組織細(xì)胞因子mRNA檢測(cè) 取各組小鼠背部皮膚，采用TRIzol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，采用Bio-RAD iScript cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行SOCS1、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1、干擾素（IFN）-γ細(xì)胞因子的cDNA反轉(zhuǎn)錄，用C1000-PCR 儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃5 s，65 ℃ 5 s 30 個(gè)循環(huán)，采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。具體引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清熱涼血方對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損作用 在造模過程中肉眼觀察各組小鼠一般狀況可，未出現(xiàn)感染、死亡等情況，小鼠毛發(fā)密度及光澤度未見明顯變化；空白組小鼠背部備皮區(qū)皮膚光滑，無紅腫、鱗屑、糜爛等；模型組小鼠自造模第2天開始在備皮區(qū)開始逐漸出現(xiàn)浸潤(rùn)性紅斑、厚層銀白色鱗屑，少數(shù)出現(xiàn)散在出血點(diǎn)，隨時(shí)間的推移，紅斑、鱗屑逐漸加重，直至第8天最為嚴(yán)重；雷公藤多苷組及清熱涼血方低、中、高濃度組小鼠備皮區(qū)亦出現(xiàn)浸潤(rùn)性紅斑、銀白色鱗屑，程度均較模型組為輕。其中，清熱涼血方低、中、高濃度組小鼠皮損嚴(yán)重程度依次減輕，而雷公藤多甙組小鼠皮損程度與清熱涼血方高濃度組小鼠大致相同，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠皮損變化情況

2.2 各組小鼠靶皮損組織病理變化情況 將各組小鼠靶皮損行常規(guī)HE染色，空白組組織學(xué)特征表現(xiàn)為角質(zhì)層為1～3層，棘層細(xì)胞3～5層，基底層細(xì)胞完整，真皮淺層及血管周圍未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組及清熱涼血方各組小鼠組織病理表現(xiàn)為角化過度伴角化不全，棘層增厚，表皮突下延，真皮淺層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，基本符合銀屑病樣改變，其程度與肉眼觀察結(jié)果相符，即清熱涼血方低、中、高濃度組小鼠病理嚴(yán)重程度依次減輕，而雷公藤多甙組小鼠病理嚴(yán)重程度與清熱涼血方高濃度組小鼠大致相同。見圖2。

圖2 各組小鼠HE染色病理改變 （HE染色×400）

2.3 各組小鼠靶皮損組織細(xì)胞因子PCR變化情況通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)空白組、模型組、雷公藤多甙組、清熱涼血方低、中、高濃度組小鼠皮膚組織中 SOCS1、STAT3、TNF-α、IL-6、IL-1、IFN-γ mRNA表達(dá)水平差異。結(jié)果顯示：各指標(biāo)在模型組皮膚中mRNA表達(dá)水平均較空白組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤多苷組及清熱涼血方不同濃度組各指標(biāo)mRNA表達(dá)水平均較空白組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），較模型組不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，以清熱涼血方高濃度組下降最為明顯，其次依次為雷公藤多甙組、中濃度組、低濃度組。見圖3～14。

圖3 各組SOCS1mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖4 各組SOCS1mRNA相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)增曲線

圖5 各組STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖6 各組STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)增曲線

圖7 各組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖8 各組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)增曲線

圖9 各組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖10 各組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)增曲線

圖11 各組IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖12 各組IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)增曲線

圖13 各組IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖14 各組IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)增曲線

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑為主要臨床表現(xiàn)，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其發(fā)生發(fā)展可能與細(xì)胞因子、信號(hào)通路等密切相關(guān)。該病頑固難治、極易復(fù)發(fā)，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生極為嚴(yán)重的影響，是皮膚病研究熱點(diǎn)之一。

近年來中醫(yī)中藥治療銀屑病的有效性及安全性逐漸被重視?！扒鍩釠鲅健笔枪P者導(dǎo)師白彥萍教授基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，結(jié)合銀屑病特點(diǎn)、現(xiàn)代藥理學(xué)及循證醫(yī)學(xué)研究，以“犀角地黃湯”為基礎(chǔ)方加減而成的自擬方，有清熱涼血解毒作用。本課題組前期的隨機(jī)平行對(duì)照試驗(yàn)驗(yàn)證了清熱涼血方（祛銀顆粒）的有效性和安全性[2]，采用鼠尾鱗片和鼠陰道上皮模型證實(shí)其可通過抑制上皮細(xì)胞有絲分裂并促進(jìn)顆粒層的形成干預(yù)銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[3-4]，而清熱涼血方對(duì)銀屑病分子機(jī)制的作用仍需進(jìn)一步探究。

近年研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病是與多基因遺傳相關(guān)的慢性系統(tǒng)性炎癥性皮膚病，主要臨床表現(xiàn)為鱗屑性紅斑。具體病因和病機(jī)尚未全部闡明，目前研究認(rèn)為病灶內(nèi)異常浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞（CD4+T淋巴細(xì)胞為主）是本病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，異?；罨腡細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子通過 JAKs/STATs、NF-κB、PI3K/Akt、Notch、Wnt等多條信號(hào)通路參與角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖、異常分化、真皮微血管異常增生等病理過程，從而在銀屑病的炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞等過程中發(fā)揮重要作用。其中，尤以JAKs/STATs通路作用尤為重要。銀屑病的發(fā)生發(fā)展與JAKs/STATs信號(hào)通路及相關(guān)炎性因子有關(guān)，JAKs/STATs通路在銀屑病皮損中處于活化狀態(tài)[5]，而該信號(hào)通路受SOCS1的調(diào)控[6]，高表達(dá)的SOCS1可以抑制JAKs/STATs信號(hào)通路及其下游炎性因子的表達(dá)[7]，SOCS1可通過影響該通路的活化及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展[8]。本實(shí)驗(yàn)通過銀屑病動(dòng)物模型，觀察清熱涼血方對(duì)JAKs/STATs信號(hào)通路相關(guān)因子的影響。

銀屑病動(dòng)物模型的建造方法有很多，目前實(shí)驗(yàn)中最常用的為采用咪喹莫特乳膏外用刺激產(chǎn)生銀屑病樣模型。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠自造模第2天開始于備皮區(qū)逐漸出現(xiàn)浸潤(rùn)性紅斑、銀白色鱗屑，并隨時(shí)間的推移，癥狀逐漸加重，部分出現(xiàn)散在出血點(diǎn)，直至第8天時(shí)癥狀最為明顯。HE染色觀察皮膚組織組織病理學(xué)特征，表現(xiàn)為角化過度伴角化不全，棘層肥厚，真皮淺層血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等，基本符合銀屑病組織病理學(xué)特點(diǎn)，提示造模成功。

為驗(yàn)證清熱涼血方對(duì)銀屑病樣小鼠模型的作用，以雷公藤多苷作為陽性對(duì)照組，觀察不同濃度清熱涼血方對(duì)小鼠模型的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清熱涼血方對(duì)銀屑病樣小鼠模型有治療作用，這種治療作用不僅表現(xiàn)為皮損的改善，而且表現(xiàn)在JAKs/STATs信號(hào)通路及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化上；此外，這種改善呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。模型組小鼠皮膚組織中 STAT3、TNF-α、IL-6、IL-1、IFN-γ 的 mRNA 表達(dá)水平與空白組相比呈升高變化，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這在一定程度上符合銀屑病的疾病特征。清熱涼血方不同濃度組小鼠皮損中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平較模型組不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中清熱涼血方高濃度組對(duì)其調(diào)控水平較雷公藤多甙組更為顯著，提示清熱涼血方對(duì)銀屑病樣小鼠模型有治療作用，并且可能通過抑制JAKs/STATs信號(hào)通路的表達(dá)抑制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌發(fā)揮治療作用。

需要注意的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中雷公藤多苷組及不同濃度清熱涼血方組小鼠皮損中SOCS1的表達(dá)水平均較模型組下降，這可能與SOCS1受到炎性因子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，炎性因子的變化為一個(gè)連續(xù)的過程，而筆者的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)單一，這也可能是未完全呈現(xiàn)其變化趨勢(shì)的原因之一。