LY3023414靶向抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡

楊麗亞，劉彩玉

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北恩施445000）

非黑色素瘤皮膚癌（Nom-melanoma skin cancer） 是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，包括鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌[1-2]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，超過20%的人在一生中可能會(huì)患上皮膚癌，并且近十年來其發(fā)病率呈升高的趨勢(shì)[3]。目前，皮膚癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)、放療和化療，晚期皮膚癌患者預(yù)后并不理想[4]。因此，開發(fā)治療皮膚癌的新型高效藥物是很有意義的。

磷脂醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)（PI3K/AKT/mTOR）級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)是研究較多的致癌/抗癌途徑[5]。PI3K/AKT/mTOR途徑的過度激活在皮膚癌和其他腫瘤生物學(xué)行為中都有發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)胞存活、增殖、遷移、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和轉(zhuǎn)化[6-7]。于是，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)系統(tǒng)是治療及預(yù)防皮膚癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，開發(fā)的一些PI3K/AKT/mTOR抑制劑已在臨床前或臨床腫瘤治療中進(jìn)行了研究[8]。

最新研究開發(fā)出的一種新型的、有效的、口服生物可用的PI3K/mTOR雙向抑制劑（LY3023414），其還能阻斷AKT信號(hào)傳導(dǎo)[9]。本研究觀察LY3023414對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑 LY3023414購買于北京AdooQ Bioscience公司，其他PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑（納巴霉素、OSI-027、MK-2206和渥曼青霉素）購買于上海 Selleck公司，Annexin V-FITC/PI和CCK8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，兔anti-Cleaved-caspase-3、兔 anti-CleavedPARP、兔 antip-P85（Y458）、兔 anti-P85、兔 anti-p-AKT（S473 and T308）、兔 anti-AKT、兔 anti-p-S6K（T389）、兔anti-S6K和兔anti-β-actin購自英國Abcam公司，Caspase-glot-3/9活性測(cè)定試劑盒購買于美國Promega公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）單鏈DNA（ss DNA）試劑盒購買于武漢華美生物有限公司。

1.1.2 主要儀器 CY78-5型單人超凈臺(tái)（蘇州華新空調(diào)凈化有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海醫(yī)用分析儀器廠）；Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀（DX540，美國）；SDS-PAGE凝膠電泳儀（型號(hào)DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）；成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國），F(xiàn)ACS-Calibur流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù) TE354T細(xì)胞、原代Pri can-1細(xì)胞、原代Pri can-2細(xì)胞、人皮膚黑素細(xì)胞、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞由武漢巴菲爾生物有限公司提供，且均采用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（DMEM）高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5% CO2、4℃恒溫，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右時(shí)，便可開始傳代培養(yǎng)。LY3023414（5、10、50、100、200nmol/L）分別處理人皮膚基底細(xì)胞（TE354T）細(xì)胞24h、48h及72h后，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。100 nmol/L的LY3023414處理原代Pri can-1細(xì)胞、原代Pri can-2細(xì)胞、人皮膚黑素細(xì)胞、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞48 h后，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 CCK8實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，經(jīng)LY3023414處理后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100μL含10μL的CCK8試劑的DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞吸光度OD值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。計(jì)算公式如下：細(xì)胞相對(duì)存活率（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.2.2 Caspase活性實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，然后經(jīng)LY3023414處理細(xì)胞48 h后，Caspase-glot-3/9活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)Caspase-3/9活性，采用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.2.3 ssDNA凋亡ELISA 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，然后加入LY3023414處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞裂解，取上清液，ss DNA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒分析裂解液中ss DNA水平，采用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)定其吸光度值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，然后加入100nmol/L的LY3023414處理細(xì)胞48 h后，棄去舊培養(yǎng)液，消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞（按照試劑盒操作說明書進(jìn)行），最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況。

1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液，4℃條件下12000r/min（離心半徑10 cm）離心12 min，收集上清。二辛喹酸（BCA）法檢測(cè)了上清中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg進(jìn)行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后在恒流275 mA條件下電轉(zhuǎn)70 min，5%脫脂牛奶封閉1 h后，將目的條帶放入對(duì)應(yīng)的一抗溶液（稀釋比1∶1000）中，4℃搖床孵育過夜。洗膜緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次，再把條帶放入盛二抗（稀釋比 1∶3 000）的平皿中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入4mL的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影液（ECL）顯色3 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY3023414抑制TE354T細(xì)胞增殖 采用不同濃度 LY3023414（5～200 nmol/L）分別處理 TE354T細(xì)胞24 h、48 h及72 h后，結(jié)果提示LY3023414處理細(xì)胞48 h后對(duì)TE354T細(xì)胞的增殖活性有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性（P<0.05）。LY3023414干預(yù)TE354T細(xì)胞48 h后，其半數(shù)抑制率（IC50）大約在100 nmol/L，見圖1A。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LY3023414呈濃度依賴性的減少TE354T細(xì)胞克隆數(shù)（P<0.05），見圖1B。BrdU ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LY3023414呈濃度依賴性的降低TE354T細(xì)胞的吸光度（P<0.05），見圖1C。細(xì)胞周期考察發(fā)現(xiàn)，LY3023414處理TE354T細(xì)胞48 h，G0-G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，而S期和G2-M期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05），見圖 1D。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用原代人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞（Prican-1和Prican-2）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)100 nmol/L的LY3023414處理Pri can-1和Pri can-2細(xì)胞48 h后，能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖能力（P<0.05），見圖1E。另外，采用100 nmol/L的LY3023414處理皮膚黑素細(xì)胞、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)上述3種細(xì)胞增殖活性沒有明顯影響（P<0.05），見圖 1F。

圖1 LY3023414降低TE354T細(xì)胞增殖活性

2.2 LY3023414誘導(dǎo)TE354T細(xì)胞凋亡 進(jìn)一步觀察LY3023414對(duì)TE354T細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示LY3023414呈劑量依賴性的誘導(dǎo)TE354T細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Caspase-3的活性，見圖2A；同時(shí)LY3023414呈劑量依賴性的誘導(dǎo)促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表達(dá)，見圖2B。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物單鏈DNA（ss DAN）的水平檢測(cè)，提示LY3023414呈劑量依賴性的增高ss DAN的含量，見圖2C。實(shí)驗(yàn)還采用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)分析LY3023414對(duì)TE354T細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)100 nmol/L的LY3023414處理細(xì)胞48 h后，能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，見圖2D、E。

100 nmol/L的LY3023414處理Pri can-1和Pri can-2細(xì)胞48h后，能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（P<0.05），見圖2F。另外，采用100 nmol/L的LY3023414處理皮膚黑素細(xì)胞、皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)上述3種細(xì)胞中ss DAN水平?jīng)]有明顯影響（P<0.05），見圖2G。

圖2 LY3023414誘導(dǎo)TE354T細(xì)胞凋亡

2.3 LY3023414對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響 LY3023414是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路潛在的、新的抑制劑，于是進(jìn)一步觀察PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)活性。100 nmol/L的LY3023414處理TE354T和Pri can-1細(xì)胞48 h后，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路靶蛋白 P85（Y458）、AKT（S473 和 T308）和S6K（T389）的磷酸化水平均降低，而 P85、AKT1/2和S6K1表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化，見圖3A、B。然而，皮膚成纖維細(xì)胞中P85、AKT1/2和S6K1表達(dá)水平相對(duì)較低，而且 LY3023414 對(duì) P85（Y458）、AKT（S473 和T308）和S6K（T389）的磷酸化水平也沒有明顯影響，見圖3C。

圖3 LY3023414對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

2.4 不同PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑對(duì)TE354T細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較LY3023414（LY）和其他PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑，包括雷帕霉素（Rap）、mTOR 激酶抑制劑 OSI-027（OSI）、AKT特異性抑制劑MK-2206（MK）和渥曼青霉素（WT），抗TE354T細(xì)胞增殖的活性。LY3023414相比于同濃度的其他抑制劑更能明顯抑制TE354T細(xì)胞的增殖活性，見圖4A。同樣的，LY3023414相比于同濃度的其他抑制劑更能明顯增高TE354T細(xì)胞凋亡標(biāo)志物ss DNA的水平，見圖4B。

圖4 PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑降低TE354T細(xì)胞增殖活性

3 討論

臨床研究表明，人皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌組織中PI3K/AKT信號(hào)通路過度激活，提示該信號(hào)系統(tǒng)是導(dǎo)致皮膚癌發(fā)病的機(jī)制[10-11]。已有研究證實(shí)，人皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌中p-AKT免疫熒光結(jié)果為陽性，并且p-AKT表達(dá)水平在鱗狀細(xì)胞癌中相對(duì)于基底細(xì)胞癌更高[1-2]。因此，PI3K/AKT信號(hào)抑制是治療皮膚癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。本文研究中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了新的PI3K/AKT/mTOR抑制劑LY3023414對(duì)TE354T細(xì)胞系、原代人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞有不良反應(yīng)。LY3023414誘導(dǎo)TE354T細(xì)胞停滯在G0/G1-S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。與此同時(shí)，LY3023414通過激活caspase-3/9活性誘導(dǎo)TE354T細(xì)胞凋亡。

mTOR位于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的中心位置，已發(fā)現(xiàn)至少2種mTOR復(fù)合體（mTORC1和mTORC2）[13]。本文研究發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑LY3023414對(duì)人皮膚基底細(xì)胞癌TE354T細(xì)胞的藥物毒性作用相比于mTORC1抑制劑納巴霉素、OSI和WT更強(qiáng)?？赡艿慕忉屖且种苿┘{巴霉素和OSI-027只能僅僅抑制mTOR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，而LY3023414能阻斷整個(gè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。更有趣的是，LY3023414素對(duì)TE354T細(xì)胞增殖的抑制作用也明顯優(yōu)于WT，可能是由于LY3023414同時(shí)干擾了其他致癌信號(hào)傳導(dǎo)的活化，比如GSK-3β/CREB信號(hào)通路[15]。本文結(jié)果還提示LY3023414可以降低PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路靶蛋白P85（Y458）、AKT（S473和 T308）和 S6K（T389）的磷酸化水平，進(jìn)而誘導(dǎo)了TE354T細(xì)胞的早期和晚期凋亡，還降低了促凋亡蛋白Cleaved casapase-3和Cleaved PARP的表達(dá)，并且呈濃度依賴性的促使凋亡標(biāo)志物ssDNA的水平。

綜上所述，LY3023414通過靶向抑制 PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化，降低了人皮膚基底細(xì)胞癌TE354T細(xì)胞的增殖活力，并誘導(dǎo)了其凋亡。研究結(jié)果為L(zhǎng)Y3023414臨床上治療人皮膚基底細(xì)胞癌提供合理的依據(jù)。