低共熔溶劑提取核桃青皮多酚工藝優(yōu)化及其抑菌活性

汪 濤，梁 亮，李旭銳，胡雪芳，孫君社，裴海生

低共熔溶劑提取核桃青皮多酚工藝優(yōu)化及其抑菌活性

汪 濤，梁 亮，李旭銳，胡雪芳，孫君社，裴海生※

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，北京 100121；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100121）

為了充分利用核桃副產(chǎn)物，減少環(huán)境污染，該研究以核桃青皮為研究對象，分別采用不同pH值（3、7、10）水溶液、50%乙醇溶液和低共熔溶劑（尿素/氯化膽堿：DES-UC，草酸/氯化膽堿：DES-OC）提取多酚。首先在溫度80 ℃、液料比25 mL/g、低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents, DESs）配位劑摩爾比1.0的條件下提取60 min篩選出DES-OC提取效果較好；隨后在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法確定了DES-OC提取核桃青皮多酚的優(yōu)化工藝參數(shù)：草酸/氯化膽堿摩爾比1.0、溫度85 ℃、時(shí)間62 min、液料比50 mL/g，在此條件下多酚提取量為50.87 mg/g。另外，通過對核桃青皮多酚提取混合溶劑抑菌活性試驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)DES-OC與核桃青皮多酚混合后對大腸桿菌（）的抑菌效果較佳，金黃色葡萄球菌（）次之，最后為黃青霉（）。以上試驗(yàn)結(jié)果可為研究開發(fā)天然抑菌劑、保鮮劑等提供理論基礎(chǔ)，拓寬核桃青皮加工利用途徑的同時(shí)也為提取農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物中生物活性成分提供新思路。

提?。粌?yōu)化；低共熔溶劑；核桃青皮；多酚；抑菌活性

0 引 言

核桃（L），又名胡桃，為胡桃屬植物中經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的樹種之一。中國核桃種植面積居世界首位，同時(shí)核桃品種多、資源豐富。但核桃青皮卻未得到充分利用，長期以來，作為廢渣丟棄，造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[1-2]。核桃青皮中富含多酚物質(zhì)，如綠原酸、香草酸、槲皮素、沒食子酸、核桃酮等，有很強(qiáng)的抑菌、抗衰老、降血脂、抗癌、抗輻射等生理功效，且能有效減少氧化應(yīng)激和抑制大分子氧化[3-5]。目前已成為食品、醫(yī)藥、染色等行業(yè)研究的熱點(diǎn)課題之一，充分開發(fā)利用核桃青皮中豐富的多酚資源極具前景和意義，不僅能減少環(huán)境污染，而且能帶來一定的社會經(jīng)濟(jì)效益。

多酚易溶于極性大的溶劑，如水、乙醇、丙酮，可溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等。目前核桃青皮多酚提取技術(shù)主要集中在有機(jī)溶劑、離子沉淀、樹脂吸附分離、超臨界二氧化碳萃取、超聲浸提、微波浸提等方法。如張春媛[6]應(yīng)用螯合劑六偏磷酸鈉協(xié)同微波雙輔助得到提取量為41.2 mg/g的核桃青皮多酚；劉迪等[7]應(yīng)用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)在溫度50 ℃、壓力30 MPa、時(shí)間6 h、75%乙醇溶液、夾帶劑用量3.0 mL/g、CO2流量30 kg/h，提取量可達(dá)88.3 mg/g。但美中不足的是這些工藝過程存在能耗大、效率低、價(jià)格昂貴和污染環(huán)境等諸多問題，因此，提取核桃青皮多酚非常需要能使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松弛的綠色且廉價(jià)的溶劑。最近，提出了一種稱為低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）的新型綠色溶劑，作為生物質(zhì)加工的介質(zhì)[8]。DESs是由氫受體/氫供體組成，按合適比例混合加熱（80～100 ℃）形成的液態(tài)混合溶劑，其凝固點(diǎn)比配位劑都要低，具有不易揮發(fā)、價(jià)格低、毒性小、可回收利用、綠色環(huán)保、易制備不需純化等優(yōu)勢，是廣泛使用的新型綠色溶劑之一[9]。根據(jù)配位劑的性質(zhì)可以將DESs分為3種類型：Ｉ類由季銨鹽和氯化物（MClx）形成，該類與金屬鹵化物/咪唑鹽體系類似；Ⅱ類由水合金屬鹵化物與氯化膽堿形成；Ⅲ類由氫受體與氯化膽堿組成，氫受體通常是酰胺、羧酸或醇[10]。Ⅰ、Ⅱ類因含有金屬離子屬性不適合在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物方面的應(yīng)用，本文主要研究Ⅲ類低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents, DESs）。Tang等[11]應(yīng)用DESs提取白柏中黃酮，與傳統(tǒng)熱水浸提相比，槲皮素、楊梅素和穗花杉雙黃酮提取率分別增加了128.7%、111.7%、111.1%。Chanioti等[12]選取DESs中檸檬酸/氯化膽堿（DES-AC）和乳酸/膽堿氯化物（DES-AL）分別提取橄欖渣中酚類化合物，發(fā)現(xiàn)DES-AC所提取的總酚含量和抗氧化活性均高于均質(zhì)化、微波、超聲波和高靜水壓力輔助等方法。DESs的回收利用是提取植物活性物質(zhì)的優(yōu)勢之一，如熊蘇慧等[13]利用醋酸鈉和乳酸合成的NADESs提取玉竹中的黃酮提取量為20.13 mg/g，回收利用一次提取量仍有18.79 mg/g；Zhang等[14]重復(fù)利用DES-OC六次茯苓多糖的提取率為38.40％，較傳統(tǒng)的熱水提取提高了7.2倍。但是由于核桃青皮成分中富含醌類物質(zhì)的特殊性，DESs的回收利用是未來需要突破的關(guān)鍵技術(shù)之一。DESs黏度低有很好的滲透能力，呈弱酸性有輔助分解植物細(xì)胞壁木質(zhì)素、半纖維素及纖維素的作用[15]，使活性成分的溶出率增加。研究發(fā)現(xiàn)核桃青皮多酚對細(xì)菌和真菌有很強(qiáng)抑制能力，同時(shí)DESs也有一定的抑菌性，可為其在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)[16]。

本文使用DESs為溶劑探究對核桃青皮多酚的提取效果，優(yōu)化提取較佳效果的條件：氫受體/氫供體摩爾比、溫度、時(shí)間及液料比，旨在提高多酚提取效果，為有效利用核桃青皮及拓展DESs應(yīng)用領(lǐng)域提供理論支撐。此外，通過核桃青皮多酚與DESs混合溶劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黃青霉的抑菌活性研究，為開發(fā)天然保鮮劑提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃青皮粉：本實(shí)驗(yàn)室自制。采摘7月中下旬的青皮棉核桃，取其青皮，60 ℃烘干、粉碎，粒度為4.0 mm，防潮、冷藏條件下保存（溫度4 ℃，相對濕度0～5%），備用。

氯化膽堿，上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司；尿素、草酸、福林酚試劑、甲醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉、濃鹽酸鹽，北京化工廠；氫氧化鈉，國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心；沒食子酸，北京百靈威科技有限公司；LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，青島海博覽生物技術(shù)有限公司；吐溫80，青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司。

金黃色葡萄球菌（）、大腸桿菌（）、黃青霉（），中國科學(xué)院。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-1780型紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；GM-0.5型隔膜真空泵，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，蘇州江東精密儀器有限公司；AR223CN型電子天平，奧豪斯（常州）儀器有限公司；BCN-1360型生物潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；NDJ-1B旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；LDZX-50KBS立體式高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HS-250A恒溫恒濕培養(yǎng)箱，南京恒裕電子儀器廠；XSP-SM4型雙目生物顯微鏡，上海譜騫光學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃青皮多酚提取與測定

分別用酸性（pH值為3）、中性（pH值為7）、堿性（pH值為10）水溶液、50%乙醇溶液、DESs（尿素/氯化膽堿：DES-UC，草酸/氯化膽堿：DES-OC；配位劑摩爾比1.0）提取核桃青皮多酚。稱取1.0 g核桃青皮粉，在溫度80 ℃、液料比25 mL/g的條件下提取60 min，待提取結(jié)束后，迅速降溫終止反應(yīng)，真空（0.1 MPa）抽濾，收集濾液，定容。

精確稱取0.1 g沒食子酸溶于70%甲醇配置成1 000g/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL液于100 mL容量瓶定容，濃度分別為10、20、30、40、50g/mL。吸取沒食子酸工作液、蒸餾水（空白對照）、待測液于1.0 mL刻度試管，分別加入5.0 mL 10%福林酚試劑，搖勻。室溫反應(yīng)5.0 min，加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻室溫放置60 min，在765 nm波長條件下測定吸光度[17]。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸質(zhì)量濃度（g/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為=0.001+0.006，2=0.999，線性相關(guān)性良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多酚質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算核桃青皮中多酚的提取量（mg/g），按下列公式計(jì)算：

式中為多酚質(zhì)量濃度，g/mL；為多酚溶液體積，mL；為稀釋倍數(shù)；為樣品干質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別選取草酸/氯化膽堿摩爾比（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）、溫度（60、70、80、90、100 ℃）、時(shí)間（15、30、45、60、75、90、105、120 min）和液料比（10、20、30、40、50 mL/g）進(jìn)行單因素變量替換工藝流程中相應(yīng)的常規(guī)量，考察各因素對多酚提取效果的影響，以上每個(gè)處理均重復(fù)3次。

其中，探究草酸/氯化膽堿摩爾比對核桃青皮多酚提取效果的影響，需測定室溫（25 ℃）條件下的黏度，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的實(shí)用性。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定草酸/氯化膽堿摩爾比為1.0，利用響應(yīng)面分析法對其余3個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取溫度（1）、時(shí)間（2）及液料比（3）為自變量，以核桃青皮多酚提取量為響應(yīng)值（1），進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化多酚的提取工藝，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.4 核桃青皮多酚抑菌活性試驗(yàn)

用三點(diǎn)接種法將黃青霉（）接種到PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h后，用含有0.1%吐溫80的無菌水將孢子從PDA平板洗下，震蕩均勻，調(diào)整孢子懸浮液濃度為1.0×107孢子/mL，菌懸液現(xiàn)用現(xiàn)配。

分別吸取上述制備的菌懸液、孢子懸浮液0.02 mL接種到LB瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基涂布均勻，采用直徑為6.0 mm的無菌打孔器，打3個(gè)孔P1、P2、P3，分別加入0.05 mL無菌水、DES-OC（100%）、DES-OC-青皮多酚（100%），培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)48 h后，用十字交叉法測量抑圈圈直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值為菌落直徑。抑菌圈直徑=菌落直徑平均值－菌塊直徑。

分別將DES-OC-青皮多酚稀釋成0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL的系列溶液，按上述方法測定不同濃度DES-OC-青皮多酚的抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Design Expert 8.0.6響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件、Origin 2017和SPSS 19軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對核桃青皮多酚提取效果

根據(jù)DESs價(jià)格低、毒性小、綠色環(huán)保、易制備等特性，選擇DES-UC、DES-OC作為研究對象，與酸性（pH值為3）、中性（pH值為7）、堿性（pH值為10）水溶液及50%乙醇溶液對核桃青皮多酚的提取效果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1所示，提取核桃青皮多酚由多到少的溶劑依次為DES-OC、DES-UC、酸性（pH值為3）水溶液、50%乙醇溶液、中性（pH值為7）水溶液、堿性（pH值為10）水溶液。

注：固定因素條件為溫度80 ℃、液料比25 mL·g-1、DESs配位劑摩爾比1.0、時(shí)間60 min，上標(biāo)不同字母表示在=0.05水平顯著差異。

Note: The fixed factor conditions are temperature:80 ℃, liquid to solid ratio: 25 mL·g-1, DESs complexing agent molar ratio: 1.0, time : 60 min .

Different superscript letters indicate significant differences at=0.05 level.

圖1 溶劑對核桃青皮多酚提取效果的影響

Fig.1 Effects of extraction solvent on the extraction effects of walnut green husk polyphenols

在溫度80 ℃、液料比25 mL/g、DESs配位劑摩爾比1.0的條件下提取60 min條件下下DESs提取多酚的效果相對較好，與其獨(dú)有的理化性質(zhì)密不可分，DESs幾乎都是帶正負(fù)電荷的鹽離子，有很強(qiáng)的作用力溶于細(xì)胞間或破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，易于多酚滲透和擴(kuò)散[18]。DESs配位劑組成會顯著影響植物活性物質(zhì)的溶出，配置合成不同組分的混合物，其理化性質(zhì)有較大的差異，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇DES-OC作為后續(xù)的研究對象。

尾聲重新回到了樂章的開頭（第220至245小節(jié)）。但是，它是在Ⅳ級和弦上，通過半音上升，回到主和弦（第235小節(jié)），此時(shí)給人一種似乎又要繼續(xù)下去的感覺，然后，突然地以四個(gè)小節(jié)在弱拍上的突強(qiáng)音結(jié)束。

2.2 DES-OC提取核桃青皮多酚單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 草酸/氯化膽堿摩爾比對核桃青皮多酚提取效果的影響

由圖2a可知，隨著草酸/氯化膽堿摩爾比的增加，多酚提取量呈連續(xù)降低的趨勢。DESs具有分子結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，氫供體/氫受體摩爾比的大小變化，使DESs極性、黏度、pH值等理化性質(zhì)有了相應(yīng)的差異，從而影響多酚的提取效果[19]。其中，DESs的黏度對多酚提取效果有顯著的影響（<0.05），由圖3可知，在草酸/氯化膽堿摩爾比在0.5～2.5范圍內(nèi)，DES-OC的黏度變化較大呈先降低后上升的趨勢。DES-OC黏度降低，傳質(zhì)效果得到相應(yīng)的改善，增加了多酚在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)；相反，黏度過高，導(dǎo)致能量傳遞緩慢，嚴(yán)重阻礙多酚從細(xì)胞傳質(zhì)到溶劑介質(zhì)中的效率。另外，高黏度的DES-OC會導(dǎo)致后續(xù)多酚的分離、純化和濃縮等下游技術(shù)的困難，增加運(yùn)營成本，影響實(shí)際應(yīng)用。綜合考慮，選取草酸/氯化膽堿摩爾比1.0作為后續(xù)研究的參數(shù)。

2.2.2 溫度對核桃青皮多酚提取效果的影響

由圖2b可知，溫度對核桃青皮多酚提取效果有顯著影響，隨溫度的升高呈先增加后降低的趨勢，在80 ℃時(shí)達(dá)到最大。提高溫度降低DES-OC的黏度加速分子運(yùn)動，使多酚更易于從細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)散到溶劑中進(jìn)而提高多酚的提取效果；但當(dāng)高于臨界溫度80 ℃時(shí)，由于多酚化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，溫度過高易發(fā)生降解。另外，核桃青皮中的多糖、蛋白、果膠等活性物質(zhì)溶出增加，使溶劑相對濃度差減小，黏度增大，不利于多酚從細(xì)胞溶出[20-21]。綜合考慮，選取70、80、90 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 時(shí)間對核桃青皮多酚提取效果的影響

由圖2c可知，核桃青皮多酚提取量隨著時(shí)間的延長而增加，當(dāng)延長至75 min時(shí)提取量最大，繼而隨著時(shí)間的延長而減少。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，延長提取時(shí)間可以增加多酚的溶出量，但當(dāng)繼續(xù)延長時(shí)，多酚已基本溶出或溶劑對物料的作用達(dá)到某種平衡，并且時(shí)間過長會破壞多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)，影響多酚的提取效果[22-23]。綜合考慮，選取60、75、90 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 液料比對核桃青皮多酚提取效果的影響

由圖2d可知，核桃青皮多酚提取量隨著液料比的增加呈先增加后降低的趨勢，液料比為40 mL/g時(shí)反應(yīng)體系達(dá)到平衡提取量最大。增加溶劑使核桃青皮粉顆粒的可擴(kuò)散空間增加，使有效接觸面積增加提高了傳質(zhì)推動力，同時(shí)使植物組織的浸潤破裂效果更好，增加了多酚在溶劑中的溶解量；溶劑太少過于黏稠使物質(zhì)間相互的作用力太小使多酚溶出率降低[24]。同時(shí)不當(dāng)?shù)囊毫媳纫矔?dǎo)致下游技術(shù)更復(fù)雜困難。綜合考慮，選取30、40、50 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 提取核桃青皮多酚響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定尿素/氯化膽堿摩爾比為1.0，以溫度（1）、時(shí)間（2）和液料比（3）3個(gè)因素為自變量，以多酚提取量為響應(yīng)值（1），采用響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括17組試驗(yàn)方案。試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 模型建立與方差分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析（見表3），對擬合回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚提取量（1）與溫度（1）、時(shí)間（2）、液料比（3）的二次響應(yīng)面回歸方程為

回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小，決定了各因素對響應(yīng)值影響的主次順序，所以各因素對多酚提取量的影響由大到小依次為123，即溫度、時(shí)間、液料比，本試驗(yàn)所建模型中12312影響均極顯著（<0.01），23132232影響均顯著（<0.05）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

從表3可知，以多酚提取量為響應(yīng)值時(shí)，模型=0.002<0.01，表明該二次方程模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（>0.05），說明該模型成立。模型的決定系數(shù)2=0.997，說明該模型試驗(yàn)值與預(yù)測值高度擬合；校正決定系數(shù)2Adj=0.996，表明有99.64%的響應(yīng)值變化可以用模型來解釋，且2和2Adj均接近1，說明模型準(zhǔn)確性和通用性較高；變異系數(shù)CV=1.90%＜10%，說明試驗(yàn)的可信度與精確度高，所以可以用此模型對核桃青皮多酚提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 回歸方程的方差分析

注：“*”表示差異顯著（<0.05）；“* *”表示差異極顯著（<0.01）。

Note: “*” indicating significant difference (<0.05); “* *” indicating extremely significant difference (<0.01).

2.3.3 響應(yīng)面圖形分析與優(yōu)化

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的響應(yīng)面如圖4所示。溫度和時(shí)間交互作用的等高線幾乎呈圓形，表明兩者交互作用對核桃青皮多酚的提取效果無顯著影響，從三維圖可以看出，隨溫度和時(shí)間的增加多酚提取量呈先增大后減小的趨勢；溫度與液料比相互作用的等高線呈橢圓形，表明兩者相互作用極顯著，從三維圖可以看出，隨溫度和液料比的增加多酚提取量呈先增加后減小的趨勢；液料比與時(shí)間相互作用的等高線呈橢圓形更為明顯，表明兩者相互作用極為顯著，這與方差分析結(jié)果基本一致。

通過 Design Expert 8.0.6 軟件分析得到核桃青皮多酚的優(yōu)化提取條件溫度85 ℃，時(shí)間62 min，液料比50 mL/g，理論多酚提取量50.91 mg/g。采用理論優(yōu)化提取條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，得到多酚提取量平均值為50.87 mg/g，與理論值相比，相對誤差為2.03%，說明該模型可以較好地模擬和預(yù)測核桃青皮多酚提取量，從而證明提取參數(shù)的可行性。

2.4 核桃青皮多酚抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果分析

DES-OC、DES-OC-青皮多酚對3種受試菌均具有一定抑菌作用（圖5）。

根據(jù)抑菌圈判定依據(jù)[24]：菌圈直徑大于15.0 mm為高度敏感，10.0～15.0 mm為中度敏感，7.0～9.0 mm為低度敏感，無抑菌圈者不敏感。由表4可知，DES-OC對和抑菌活性中度敏感、抑菌活性高度敏感。核桃青皮多酚有一定的抗菌性，當(dāng)DES-OC中存在青皮多酚時(shí)，從表4可以看出，DES-OC-青皮多酚較單一的DES-OC對3種受試菌抑菌效果更好，即和抑菌活性提高到高度敏感，的抑菌活性則更加強(qiáng)烈（抑菌圈直徑達(dá)到31.7±0.16 mm）。

表4 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果（抑菌圈直徑）

注：“－”表示沒有觀察到抑菌圈，下同。

Note: “－”means that the inhibition zone is not observed. The same below.

表5為不同濃度的DES-OC-青皮多酚對抑菌活性效果。DES-OC-青皮多酚對在0.05～0.40 mg/mL濃度范圍內(nèi)均有抑菌圈的出現(xiàn)。在DES-OC-青皮多酚濃度高于0.35 mg/mL時(shí)高度敏感；在0.05～0.40 mg/mL濃度范圍均有敏感性，在濃度高于0.35 mg/mL時(shí)高度敏感；在0.05～0.40 mg/mL濃度范圍內(nèi)處于低中度敏感。該試驗(yàn)結(jié)果充分說明DES-OC-青皮多酚對的抑菌效果最佳，次之，最后為。

表5 不同濃度DES-OC-青皮多酚的抑菌圈直徑

3 結(jié) 論

1）本文采用低共熔溶劑（DESs）提取核桃青皮多酚，篩選確定草酸/氯化膽堿（DES-OC）提取多酚效果較好。

2）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定草酸/氯化膽堿摩爾比1.0，采用響應(yīng)面法得到優(yōu)化工藝參數(shù)為溫度85 ℃、提取時(shí)間62 min、液料比50 mL/g，理論多酚提取量50.91 mg/g。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際多酚提取量50.87 mg/g，相對誤差為2.03%，說明該模型可以較好模擬和預(yù)測DES-OC提取核桃青皮中多酚的效果，從而證明該提取條件的可行性。

3）通過抑菌試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)DES-OC與核桃青皮多酚混合溶劑對金黃色葡萄球菌（）大腸桿菌（）青霉菌（）均有一定的抑菌活性效果，對的抑菌效果最佳，次之，最后為，說明在天然保鮮劑開發(fā)和應(yīng)用方面有較大的潛力。

DESs作為低成本、可食用、可選擇組合的新型綠色溶劑，為提取農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物中生物活性成分提供新思路，但DESs在提取過程中對活性成分的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的影響還需要進(jìn)一步探索。

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Optimization of the technology for deep eutectic solvents extraction and antibacterial activity of walnut green husk polyphenols

Wang Tao, Liang Liang, Li Xurui, Hu Xuefang, Sun Junshe, Pei Haisheng※

(1.,100121,; 2.,,100121,)

In order to make full use of walnut by-products and reduce environmental pollution, walnut green husk was used as the research object. Polyphenols were extracted by different pH values (3,7,10) aqueous solution, 50% ethanol solution and Deep Eutectic Solvents (urea/choline chloride: DES-UC, oxalic acid/choline chloride: DES-OC). Firstly, under the conditions of temperature 80 ℃, liquid-solid ratio 25 mL/g, and molar ratio of Deep Eutectic Solvents (DESs) complexing agent 1.0, the extraction effect of DES-OC was better under 60 min. Subsequently, on the basis of single factor experiment, the response surface methodology was used to determine the optimal process parameters for the extraction of polyphenols from walnut green husk by DES-OC : the molar ratio of oxalic acid to choline chloride was 1.0, the temperature was 85 ℃, the time was 62 min, and the liquid-solid ratio was 50 mL/g. Under these conditions, the extraction amount of polyphenols was 50.87 mg/g. In addition, through the study on the antibacterial activity of the mixed solvent extracted from walnut green husk polyphenols, it was found that the antibacterial effect of DES-OC mixed with walnut green husk polyphenols onwas better, followed byand. The results can provide a theoretical basis for the research and development of natural antibacterial agents and preservatives, broaden the processing and utilization of walnut green husk, and also provide new ideas for the extraction of bioactive components from by-products of agricultural products.

extraction; optimization; deep eutectic solvents; walnut green husk; polyphenols; antibacterial activity

汪濤，梁亮，李旭銳，等. 低共熔溶劑提取核桃青皮多酚工藝優(yōu)化及其抑菌活性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(5)：317-323.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.037 http://www.tcsae.org

Wang Tao, Liang Liang, Li Xurui, et al. Optimization of the technology for deep eutectic solvents extraction and antibacterial activity of walnut green husk polyphenols[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(5): 317-323. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.037 http://www.tcsae.org

2020-08-31

2021-02-09

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21776142）。

汪濤，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。Email：wangtao17190191990@126.com。

裴海生，高級工程師，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源綜合利用方面的研究。Email：peihaisheng2001@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.037

TS209

A

1002-6819(2021)-05-0317-07