惡性黑色素瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a表達(dá)及與病理特征和預(yù)后的關(guān)系研究

趙宏圻 斯向東

惡性黑色素瘤主要發(fā)生于皮膚、黏膜或色素膜[1]。近年來(lái)，惡性黑色素瘤發(fā)病率和病死率不斷增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅人們的生活質(zhì)量及生命健康，引起廣泛關(guān)注[2]。惡性黑色素瘤早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期[3-4]，因此，尋找有效且精確的診斷和治療方法對(duì)提高惡性黑色素瘤患者生存質(zhì)量及延長(zhǎng)患者生存期十分關(guān)鍵。微小RNA（microRNA,miRNA）是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，可降解靶信使RNA或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯，調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，miRNA-186和miRNA-146a在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且發(fā)揮重要作用[5-6]，但目前關(guān)于miRNA-186和miRNA-146a表達(dá)水平與惡性黑色素瘤的關(guān)系研究較少，缺乏可靠的臨床參考依據(jù)。本研究收集惡性黑色素瘤患者腫瘤組織及瘤旁組織標(biāo)本，檢測(cè)并分析惡性黑色素瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a表達(dá)水平及與患者病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為惡性黑色素瘤的診斷和治療提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2017年1月—2021年1月浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除的93例惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織及瘤旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)證實(shí)為惡性黑色素瘤；（2）≥18歲；（3）具有完整的臨床資料；（4）具有完整的隨訪資料；（5）未經(jīng)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤者；（2）失訪者；（3）臨床資料不全者；（4）肝、腎、心、肺功能嚴(yán)重異常者；（5）嚴(yán)重精神疾病者；（6）手術(shù)禁忌者；（7）妊娠或哺乳期婦女。納入的93例患者中，男56例，女37例；年齡32～75（56.61±8.29）歲。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司（批號(hào)：15596018），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司（批號(hào)：K1622）。使用的Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）測(cè)定miRNA-186和miRNA-146a表達(dá)；取患者腫瘤組織和瘤旁組織剪碎并研磨，采用TRIzol試劑提取組織中總RNA，取1 μl RNA溶液紫外光分度計(jì)測(cè)定吸光度（OD）260/OD280和純度，取5 μl總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并檢測(cè)總RNA的純度和完整度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因，檢測(cè)miRNA-186和miRNA-146a表達(dá)。取cDNA進(jìn)行qRT-PCR。miRNA-186引物序列：正向引物5'-CCCGATAAAGCTAGATAACC-3'，反向引物 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miRNA-146a引物序列：正向引物5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3'，反向引物5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3'。反應(yīng)體系：SYBR Green I Master 10.0 μl，正向引物 1.0 μl，反向 引 物1.0 μl，DNA 模板 2.0 μl，RNase-Free H2O 8.5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s、60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.4 預(yù)后評(píng)價(jià) 隨訪至2022年1月，評(píng)估患者預(yù)后情況，主要采取門診復(fù)診、電話、微信、上門隨訪等多種方式進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo) （1）比較腫瘤組織與瘤旁組織miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量；（2）比較不同病理特征患者腫瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量；（3）比較不同預(yù)后情況患者腫瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用近似t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素logistic回歸分析影響惡性黑色素瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織與瘤旁組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量比較 腫瘤組織miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 腫瘤組織與瘤旁組織miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 不同病理特征患者腫瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量的比較 不同性別、年齡、腫瘤部位和Clark分級(jí)患者腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。Ⅳ期患者腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于Ⅱ期和Ⅲ期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（均P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤部位和Clark分級(jí)患者腫瘤組織中miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；Ⅳ期患者腫瘤組織中miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于Ⅱ期和Ⅲ期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同病理特征患者腫瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 不同預(yù)后情況患者腫瘤組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量的比較 隨訪至2022年1月，93例惡性黑色素瘤患者中生存74例，死亡19例。死亡組腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于生存組，miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于生存組（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后情況患者癌組織中miRNA-186和miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量的比較

2.4 影響惡性黑色素瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析多因素logistic回歸分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miRNA-186表達(dá)和miRNA-146a表達(dá)是影響惡性黑色素瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

表4 影響惡性黑色素瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

目前，惡性黑色素瘤的具體發(fā)病原因尚未完全闡明[7-10]。惡性黑色素瘤早期癥狀不典型，多數(shù)患者未引起重視及及時(shí)就診，確診時(shí)錯(cuò)失了最佳根治時(shí)機(jī)；惡性黑色素瘤晚期轉(zhuǎn)移早、發(fā)展迅速、預(yù)后較差，傳統(tǒng)治療效果不理想，且病死率高等[11-13]。

miRNA由基因組DNA編碼，在RNA聚合酶Ⅱ作用下被轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)靶基因，并在細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密[14-15]。近年來(lái)，miRNA在腫瘤診斷上的作用及腫瘤基因治療方法研究成為熱點(diǎn)[16-18]。惡性腫瘤是多基因異常的一種疾病，由于原癌基因表達(dá)激活或抑癌基因突變?nèi)笔В辜?xì)胞逃逸正常生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致無(wú)限增殖和侵襲。研究證實(shí)某些miRNA在腫瘤中異常表達(dá)，可刺激腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成[19]。miRNA-186位于1P31.1染色體上，是一種與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的微小RNA[20]。劉沖等[21]發(fā)現(xiàn)，相比健康人群和慢性肝炎患者，肝細(xì)胞性肝癌患者血清miRNA-186相對(duì)表達(dá)量較高，利用miRNA-186表達(dá)水平診斷肝癌的靈敏度達(dá)78.18%，特異度達(dá)63.64%，推測(cè)miRNA-186可能是肝癌標(biāo)志基因。miRNA-146a在多種腫瘤增殖、生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移中作為抑癌基因還是癌基因尚無(wú)明確定論[22]。陳霖霖等[23]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌患者miRNA-146a表達(dá)低于甲狀腺結(jié)節(jié)患者，且與腫瘤長(zhǎng)徑＞2 cm、臨床分期Ⅲ期、有包膜侵犯及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤患者腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于瘤旁組織，而miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量卻低于瘤旁組織，可見(jiàn)惡性黑色素瘤患者miRNA-186高表達(dá)而miRNA-146a低表達(dá)；Ⅳ期患者腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于Ⅱ期和Ⅲ期患者，而miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于Ⅱ期和Ⅲ期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，而miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，可見(jiàn)惡性黑色素瘤患者miRNA-186和miRNA-146a異常表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；死亡組腫瘤組織中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量高于生存組，而miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量低于生存組，可見(jiàn)惡性黑色素瘤患者miRNA-186和miRNA-146a異常表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，惡性黑色素瘤組織中miRNA-186高表達(dá)，而miRNA-146a低表達(dá)，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。