五種重要犬病毒微流控芯片檢測方法的建立及應(yīng)用

（上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

狂犬病毒（rabies virus，RV）、偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）、犬 瘟 熱 病 毒（canine distemper virus，CDV）、犬 細 小 病 毒（canine parvovirus，CPV）和犬冠狀病毒（canine coronavirus，CCV）是5 種重要的犬科動物傳染病病原，嚴重影響犬科動物的健康[1～6]。微流控芯片技術(shù)（microfluidic chip assay）是一種基于環(huán)等溫擴增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP）的高通量快速核酸檢測技術(shù)。它將不同病原特異性引物固化在同一塊塑料芯片不同的微孔反應(yīng)槽內(nèi)；這些微孔反應(yīng)槽與加樣孔相連，通過離心把待檢核酸樣本均勻地甩入各微孔反應(yīng)槽內(nèi)；每塊塑料芯片有8 個加樣孔，每個加樣孔與4 個微孔反應(yīng)槽相連，故理論上在1 塊芯片的8 個加樣孔加入同一份待檢核酸，可以實現(xiàn)32 種不同病原的同步檢測[7]。與傳統(tǒng)PCR 或者熒光PCR 的單病原檢測相比，微流控檢測技術(shù)使高通量同時篩查多重犬科動物疫病成為可能，但微流控檢測的技術(shù)原理為LAMP，其檢測的敏感性與LAMP 檢測方法一致，介于PCR 和熒光PCR。

本研究在建立針對RV、PRV、CDV、CPV和CCV LAMP 檢測方法的基礎(chǔ)上，將這些單病原LAMP 檢測體系固化于芯片微孔反應(yīng)槽內(nèi)，制備了5 種犬科動物病毒微流控檢測芯片，并用不同的病毒樣本及臨床樣本進行測試，確認了建立的微流控芯片檢測方法的有效性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

TRIzol，購自Invitrogen 公司；Taq酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、隨機引物，購自Takara 公司；Bst DNA 聚合酶，購自美國NEB公 司；DNA 抽 提 試 劑 盒（QIAamp DNA Blood Mini Kits），購自QIAGEN 公司；微流控芯片及微流控檢測儀，購自上海速芯生物科技有限公司。其他試劑，均購自國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 病毒樣品來源及處理

RV、PRV、CDV、CPV 和CCV 等毒株和相關(guān)臨床樣本，由本單位保存?zhèn)溆?；仙臺病毒（Sendai virus，SV）和鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus，MHV），由上海實驗動物中心提供；淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）陽性質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

將待檢組織或糞便等臨床樣品加等體積PBS研磨勻漿，3 000 r/min離心15 min，收集上清液待檢。

1.3 核酸抽提及cDNA 模板制備

對于RV、CDV、CCV 待檢樣品，取100 μL上清液或血清，加入1 mL TRIzol 試劑提取RNA，并將提取的RNA 溶解于30 μL DEPC 水中；取11 μL RNA 溶液，加入5 倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液4 μL、dNTP 1 μL、隨機引物1 μL、RNA 酶抑制劑1 μL、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL，置于PCR 儀42 ℃反應(yīng)30 min，即得cDNA 模板。

對于PRV、CPV 待檢樣品，取200 μL 上清液或體液樣本，按照DNA 抽提試劑盒說明書提取病毒DNA，最后將提取的DNA 用100 μL DEPC 水溶解。

1.4 LAMP 引物設(shè)計與合成

使用Vector NTI Suite 軟件分析不同國家和地區(qū)分離的RV（Genbank 登錄號：CQ918139）、PRV（Genbank 登 錄 號：KT329439）、CDV（Genbank 登錄號：KF914669）、CPV（Genbank登 錄 號：MF805795）、CCV（Genbank 登 錄號：KT852997）基因保守序列。將序列在線導(dǎo)入Primer Explorer V5 軟 件（primerexplorer.jp/e/），設(shè)計上述5 種病毒的LAMP 引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 5 種犬病毒LAMP 引物序列

1.5 微流控芯片制作及檢測

微流控芯片外形如CD 盤，直徑約80 mm，由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。芯片由4個獨立單元構(gòu)成，每個單元有2 個加樣孔和8 個反應(yīng)槽，每個加樣孔與4 個反應(yīng)槽相連，但加樣孔之間以及反應(yīng)槽之間不連通。將Bst 大片段DNA聚合酶（1 μL）、聚合酶緩沖液（10 μL）、dNTP（2 μL）、熒光染料和不同引物組混合液（2 μL），混合后加至不同的反應(yīng)槽，用透明封膜將加樣槽上樣孔封閉。在同1 個獨立單元的兩個加樣孔中分別加入5 μL 待檢樣本的核酸，用透明膜密封加樣孔。將加樣孔固定于微流控檢測儀轉(zhuǎn)盤柱上，蓋好機器蓋。機器運行條件：63.5 ℃孵育45 min。反應(yīng)結(jié)束后，查看熒光擴增曲線，進行結(jié)果判定。

1.6 微流控芯片檢測CPV 敏感性試驗

為測試微流控芯片檢測方法的敏感性，將提取的CPV 感染犬的總DNA 樣本進行定量并梯度稀釋，制備濃度分別為100、101、102、103、104和105copies/mL 的DNA 模板，再使用微流控芯片方法檢測。

1.7 臨床樣本檢測

為進一步驗證建立的微流控芯片檢測方法的可靠性，將不同時期收集的6 份CDV 感染樣品（犬肺、肝、脾、腎、血液臨床樣本以及口鼻液拭子）、10 份CPV 感染樣品（犬糞便、肝、脾、肺、腎和血液臨床樣品）以及6 份CCV 感染樣品（犬糞便、肝、脾、肺、腎和血液臨床樣本），共計22 份陽性樣本和24 份健康犬糞拭子，使用微流控芯片進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 微流控芯片檢測5 種病毒特異性試驗

設(shè)置MHV、SV 和LCMV 反應(yīng)槽為陰性對照，使用5 種犬病毒的核酸樣本測試微流控芯片檢測特異性。結(jié)果（圖1～5）顯示，經(jīng)微流控芯片檢測，在 反 應(yīng)10～25 min 后，RV、PRV、CDV、CPV 和CCV 核酸樣本均出現(xiàn)了相應(yīng)熒光擴增曲線，各病毒與其他病毒之間未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，同時所有陰性對照病毒（MHV、SV、LCMV）的反應(yīng)槽均未出現(xiàn)熒光擴增信號。

圖1 微流控芯片檢測RV 特異性試驗結(jié)果

圖2 微流控芯片檢測PRV 特異性試驗結(jié)果

圖3 微流控芯片檢測CDV 特異性試驗結(jié)果

圖4 微流控芯片檢測CPV 特異性試驗結(jié)果

圖5 微流控芯片檢測犬CCV 特異性試驗結(jié)果

圖6 微流控芯片檢測犬CPV 敏感性試驗結(jié)果

2.2 CPV 敏感性試驗

使用微流控芯片方法檢測不同濃度梯度的CPV DNA 模板。結(jié)果（圖6）顯示，微流控芯片檢測CPV DNA 模板下限量為102copies/mL。

2.3 臨床樣本檢測

使用微流控芯片對22 份臨床陽性樣本和24份健康犬糞拭子進行檢測。結(jié)果顯示，經(jīng)微流控芯片檢測，所有CDV、CPV、CCV 感染犬的臨床樣本在反應(yīng)10～30 min 后，均出現(xiàn)相應(yīng)病毒熒光擴增信號，其中組織樣本的擴增信號較強，而24 份健康犬糞拭子樣本經(jīng)檢測未出現(xiàn)熒光擴增信號。該結(jié)果與PCR 檢測結(jié)果一致。

3 討論

微流控芯片檢測技術(shù)是近年來興起的高通量核酸檢測技術(shù)。它基于LAMP 檢測技術(shù)，將不同病原LAMP 檢測體系點制于圓盤形塑料基片上，通過離心將加樣孔內(nèi)的待檢核酸樣本分散到圓盤基片不同LAMP 檢測體系反應(yīng)槽中，然后通過微流控設(shè)備的光敏部件檢測反應(yīng)槽中熒光染料信號變化，以判定是否有目的基因特異性擴增[8-9]。理論上，該技術(shù)可以實現(xiàn)30 多種病原的同步檢測。由于微流控芯片檢測原理仍然是LAMP 技術(shù)，其檢測的特異性、敏感性和可靠性與LAMP 技術(shù)相近。本研究嘗試將RV、PRV、CDV、CPV 和CCV 等5 種犬病毒LAMP 反應(yīng)體系點制于微流控芯片上，研究將微流控技術(shù)應(yīng)用于多種犬病毒快速檢測的可行性。通過特異性試驗，證實微流控芯片檢測具有良好的特異性，其僅能檢出待檢核酸中特定病毒，其他無關(guān)病毒均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。通過敏感性試驗，證實微流控芯片檢測CPV 的下限為102copies/mL，其與LAMP 和普通PCR 方法的檢測下限相近。通過對CDV、CPV 和CCV 感染犬采集的46 份臨床樣本檢測，證實微流控芯片檢測方法具有較好的穩(wěn)定性和可靠性，受試樣本未出現(xiàn)陽性漏檢和陰性誤檢出。由于LAMP 引物設(shè)計由網(wǎng)絡(luò)軟件自動生成，有些保守區(qū)域軟件無法找到合適引物，而搜索出的引物其覆蓋序列不一定保守。特別是，針對變異度較大的RNA 病毒，LAMP 檢測引物的兼容性存在一定問題，只能通過多設(shè)計幾對不同引物進行覆蓋。此外，LAMP 引物偏長，對于一些易變病毒，設(shè)計出理想的、保守度高的引物十分困難。當(dāng)然，作為一種技術(shù)和設(shè)計理念的創(chuàng)新，微流控技術(shù)有其可取的一面，它使得同步高通量篩查多種病原成為可能[10]。

本研究建立了5 種重要犬病毒的微流控芯片檢測方法，與傳統(tǒng)PCR 方法相比，微流控芯片檢測周期較短，僅需40 min 就可完成多種病毒的同時檢測，操作簡單、檢測設(shè)備便攜（筆記本類似大小，1 次充電可運行12 h）、結(jié)果判定簡便直觀，特別適于現(xiàn)場及野外檢測。本研究建立的微流控芯片檢測新方法，不僅可應(yīng)用于出入境口岸寵物及野生動物檢疫，同時也適合野外監(jiān)測點、犬貓科動物繁育場和一線獸醫(yī)檢測實驗室使用，這對控制犬科動物重大傳染病傳播，減少特種動物養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失，保護公眾健康都具有十分重要的意義。