雞肝破裂血水綜合征病因初探

（青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266032）

近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)出現(xiàn)了一種以雞肝臟腫大出血、質(zhì)地變脆、腹腔血水為主要特征的疾病，暫命名為雞肝破裂血水綜合征。臨床發(fā)病所涉品種寬泛，白羽肉種雞、商品蛋雞、蛋種雞等均有發(fā)病，但黃羽系列未見發(fā)病。在所有種雞發(fā)病案例中，均為母系，父系正常；同一雞場(chǎng)不同品種，在飼養(yǎng)條件相同情況下，有的品種發(fā)病，有的正常；發(fā)病階段集中在育成中后期（7～20周）、產(chǎn)蛋上升期（20～35周），個(gè)別高峰期后也偶有發(fā)??；發(fā)病無(wú)地域差別，也無(wú)明顯季節(jié)性，全年均可發(fā)病，其中在秋冬或春秋季節(jié)因應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)病率相對(duì)較高；高強(qiáng)度免疫（特別是菌苗免疫）、產(chǎn)前加光等應(yīng)激因素等可加重或促進(jìn)發(fā)病，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)造成較大損失。

該病在臨床上不同于以往引起雞肝臟病變的疾病，如禽戊型肝炎（HE）、脂肪肝綜合征（FLS）、禽白血?。ˋL）、禽腺病毒病和霉菌毒素中毒等[1-5]。近期，國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)于該病的發(fā)病原因也做了大量工作，對(duì)可引發(fā)雞肝臟問(wèn)題的傳染性疫病進(jìn)行了初步篩查，認(rèn)為該病主要由禽戊型肝炎病毒或禽白血病病毒引起[6-8]，但樣本數(shù)量和調(diào)查范圍僅局限于個(gè)別地區(qū)的單一品種，而缺乏系統(tǒng)全面的檢測(cè)分析。本研究通過(guò)對(duì)11 省區(qū)市的9 種品系雞共計(jì)458 份臨床肝破裂樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)雞肝破裂血水綜合征與雞體本身存在遺傳性自身免疫性缺陷因素有關(guān)，其他如病原、應(yīng)激等因素可進(jìn)一步加重病情，但非該病的直接原因。本研究為該病的有效防控和進(jìn)一步深入研究指明了方向。

1 材料

1.1 病料來(lái)源

采自山東、河北、云南、四川等11 省區(qū)市的病料，涵蓋了國(guó)內(nèi)外的主要雞品種，共計(jì)458 份，詳見表1 和圖1。

1.2 試劑與耗材

PCR 試 劑 和Marker，為Takara 公 司 產(chǎn) 品；RT-PCR 試劑，為湖南艾克瑞公司產(chǎn)品；50×TAE buffer，為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；Goldview 核酸染料，為labest 公司產(chǎn)品；瓊脂糖，為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；核酸提取純化試劑，為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；禽白血病病毒（ALV）P27 蛋白ELISA 檢測(cè)試劑盒，為愛(ài)德士公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂，為青島海博生物公司產(chǎn)品；沙顯培養(yǎng)基，為鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；彎曲桿菌培養(yǎng)基，為青島中創(chuàng)匯科公司產(chǎn)品。

表1 采集樣本基本信息 單位：份

圖1 臨床發(fā)病雞肝破裂圖片

1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器公司），離心機(jī)（eppendorf 公司），核酸提取純化儀（杭州博日科技有限公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），凝膠成像儀（上海培清科技有限公司），移液器（eppendorf 公司），以及生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 病原分離

2.1.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌采集肝臟樣本，分別接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和彎曲桿菌專用培養(yǎng)基；培養(yǎng)后對(duì)單菌落純化，分別使用鑒別培養(yǎng)基、染色鏡檢、16S rRNA 引物等進(jìn)行鑒定。分子檢測(cè)中對(duì)16S rRNA 呈陽(yáng)性的樣品進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果用Blast 在線分析軟件在Nucleotide 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，根據(jù)序列同源性鑒定細(xì)菌種屬。

2.1.2 病毒分離 方法一：將2.1.1 中檢測(cè)結(jié)果為陰性的組織樣本（選擇有代表性樣本共計(jì)33 份）預(yù)處理后離心（12 000 r/min，10 min）取上清；經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾后，通過(guò)卵黃囊和絨毛尿囊膜途徑分別接種6 日齡和9 日齡SPF 雞胚，每枚雞胚接種0.2 mL，連傳3 代，觀察胚體變化；收獲胚體肝臟、尿囊膜和尿囊液，采用PCR 和RT-PCR方法檢測(cè)馬立克病毒（MDV）、禽戊型肝炎病毒（HEV）、禽腺病毒（FAdV）和雞傳染性貧血病毒（CIAV）。方法二：將2.1.2 中的病料濾液同時(shí)接種DF-1 細(xì)胞與LMH 細(xì)胞，5～9 d 傳代1 次，連傳3 代，注意觀察細(xì)胞有無(wú)病變；收獲細(xì)胞液，DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)液應(yīng)用ELISA P27 抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALV，LMH 細(xì)胞培養(yǎng)液采用PCR 和RT-PCR方法檢測(cè)MDV、HEV、FAdV 和CIAV。

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

2.2.1 PCR、RT-PCR 采集臨床疑似肝破裂出血綜合征雞群肝臟樣本，剪碎、研磨、凍融、離心處理，采用全自動(dòng)核酸提取試劑盒提取組織DNA和RNA；分別設(shè)計(jì)MDV、ALV、HEV、FAdV、CIAV 引物進(jìn)行PCR 和RT-PCR 檢測(cè)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及目的基因見表2。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。RT-PCR 反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表2 引物序列、目的片段長(zhǎng)度以及目的基因

2.2.2 Random PCR 對(duì)2.2.1 檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣本，采用Random PCR 方法[9]進(jìn)行未知病原篩查。

2.3 病理學(xué)診斷

采集新鮮病料樣本以10%福爾馬林固定，將固定好的標(biāo)本沖洗、脫水后進(jìn)行浸蠟、包埋，然后修整組織邊緣，進(jìn)行切片；將切好的組織切片在40～45 ℃水浴鍋水面上鋪片，之后貼片，然后將載玻片置于恒溫箱烘干，用蘇木素-伊紅染色法染色，然后封片，置于顯微鏡下觀察。

2.4 內(nèi)毒素檢測(cè)（動(dòng)態(tài)濁度法）

2.4.1 溶液制備 A 為稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD 的供試品溶液，B 為加入λm 內(nèi)毒素且與A 溶液有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液，C 為用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，D 為陰性對(duì)照（檢查用水），詳見表3。

表3 各反應(yīng)樣品制備

2.4.2 加樣及反應(yīng) 預(yù)熱動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀30 min以上，將相應(yīng)溶液A、B、C、D 加至反應(yīng)管中；打開動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀系統(tǒng)軟件，進(jìn)入數(shù)據(jù)采集模塊，根據(jù)要求設(shè)置相關(guān)參數(shù)，點(diǎn)擊開始；復(fù)溶鱟試劑，沿壁分裝至反應(yīng)試管，0.1 mL/管；將每支反應(yīng)管內(nèi)混合液混勻后，插入動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀中進(jìn)行反應(yīng)。

2.4.3 結(jié)果判讀 若供試品溶液A 所有平行管內(nèi)毒素濃度平均值乘以稀釋濃度后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，則判供試品符合規(guī)定，否則判供試品不符合規(guī)定。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)

選取20 只6 周齡SPF 雞，其中試驗(yàn)組與對(duì)照組各10 只。試驗(yàn)組腹腔注射上清液（已凍融、離心、過(guò)濾除菌）2 mL/只，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水2 mL/只，觀察12 d，記錄精神、采食、死亡情況等。

2.6 流行病學(xué)調(diào)查

對(duì)臨床表現(xiàn)為肝破裂出血的樣本進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，包括品種、日齡、發(fā)病季節(jié)以及發(fā)病規(guī)律，對(duì)搜集的臨床信息進(jìn)行匯總分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原分離

3.1.1 細(xì)菌分離 11 省區(qū)市送檢的458 份肝臟樣本細(xì)菌分離結(jié)果（表4）顯示，檢測(cè)到大腸桿菌14份，占2.8%；沙門氏菌7 份，占1.5%；彎曲桿菌0 份。結(jié)果表明，發(fā)生肝破裂血水綜合征樣本中的細(xì)菌以大腸桿菌為主，零星有沙門氏菌，但分離率均較低，分離檢測(cè)沒(méi)有共性，提示肝破裂血水綜合征的發(fā)生與細(xì)菌感染無(wú)明顯相關(guān)性。

3.1.2 病毒分離 選擇典型代表性樣本33 份，采用雞胚和細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。結(jié)果顯示，F(xiàn)1—F3 代雞胚無(wú)死亡、胚體無(wú)變化，F(xiàn)1—F3 代細(xì)胞無(wú)明顯病變；采用PCR 方法檢測(cè)FAdV、CIAV、MDV，結(jié)果均為陰性；采用RT-PCR 方法檢測(cè)HEV，結(jié)果為陰性；采用ELISA 方法檢測(cè)ALV P27 蛋白，結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，可排除HEV、FAdV、CIAV、MDV、ALV 為肝破裂血水綜合征原發(fā)病原的可能性。

表4 細(xì)菌分離結(jié)果 單位：份

3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.2.1 PCR、RT-PCR 對(duì)11 省區(qū)市458 份樣本采用PCR 和RT-PCR 方法檢測(cè)送檢樣本。結(jié)果（表5）顯示，檢測(cè)到FAdV 3 份，占0.66%；HEV 1 份，占0.22%；CIAV、MDV、ALV 均為0 份。結(jié)果表明，雖然極少樣品有FAdV、HEV 等核酸陽(yáng)性檢出，但其感染與肝破裂血水綜合征臨床表征不一致，且檢測(cè)結(jié)果不具有共性，故可排除原發(fā)病原的可能性。

3.2.2 Random PCR 分別按照DNA 和RNA病毒兩種途徑進(jìn)行Random PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，按照RNA 病毒途徑的產(chǎn)物電泳未見清晰條帶，按照DNA 病毒途徑的產(chǎn)物電泳在200～2 000 bp 之間有明顯核酸條帶（圖2），提示原始病料中不存在核酸類型為RNA 的病毒，可能有核酸類型為DNA 的病毒。將按照DNA 病毒途徑擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物酶切鑒定，挑選200 個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，經(jīng)Blast 分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有插入片段均為雞的基因，即原始病料中不存在DNA 病毒。檢測(cè)結(jié)果表明疑似發(fā)生肝破裂血水綜合征的樣本中不存在RNA、DNA 病毒。

表5 PCR 和RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 單位：份

圖2 樣品Random PCR 電泳結(jié)果

3.3 病理學(xué)診斷

選取99 份經(jīng)福爾馬林固定的組織樣本，進(jìn)行病理切片觀察。結(jié)果（表6、圖3）顯示，疑似髓樣白血病/白血病病理變化0 份；疑似細(xì)菌造成的壞死性肝炎4 份，占比4.04%；疑似網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生病并發(fā)血管瘤病理變化2 份，占比2.02%；其余多數(shù)樣本均有淀粉樣滲出，未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化，占比93.94%。結(jié)果表明，送檢的肝破裂血水綜合征樣本多數(shù)以淀粉樣變?yōu)橹?，零星有?xì)菌感染，與病原檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，可進(jìn)一步排除病毒感染的可能性。

表6 病理學(xué)診斷結(jié)果

3.4 內(nèi)毒素檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果（表7）顯示，15 份樣本內(nèi)毒素超標(biāo)，占比3.3%。肝臟破裂樣本中采集血水、肝臟、個(gè)別注射部位肌肉等，通過(guò)內(nèi)毒素含量對(duì)比檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有顯著共性聯(lián)系。此外內(nèi)毒素含量偏高的樣本，肝臟檢測(cè)顯示有細(xì)菌感染，故內(nèi)毒素含量偏高，但與造成肝臟破裂出血病因沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。

3.5 動(dòng)物試驗(yàn)

SPF 雞腹腔注射后觀察12 d，發(fā)現(xiàn)雞群精神、采食正常，雞群無(wú)死亡。人為致死雞只后解剖觀察發(fā)現(xiàn)，攻毒組雞只內(nèi)臟無(wú)特征表現(xiàn)，個(gè)別肝臟出現(xiàn)片狀出血斑，顏色暗紅，有區(qū)域性淤血，對(duì)照組雞只顯示肝臟質(zhì)地良好，顏色均勻一致，兩組差異不明顯（圖4）。采用PCR 和RT-PCR 方法對(duì)兩組肝臟樣本分別進(jìn)行ALV、FADV、HEV 檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，不能復(fù)制肝破裂血水的臨床表征，進(jìn)一步說(shuō)明ALV、FADV、HEV 等病原不是造成肝破裂血水綜合征的原發(fā)病原。

圖3 不同類別肝破裂病理切片

表7 內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

圖4 攻毒后肝臟照片

3.6 流行病學(xué)調(diào)查

3.6.1 發(fā)病品種 白羽肉種雞、商品蛋雞、蛋種雞等均有發(fā)病，但黃羽系列未見發(fā)病。白羽肉種雞以A、B 品種發(fā)病較重，D 品種發(fā)病輕，C 品種未發(fā)?。坏半u系列A、B、C 品種發(fā)病較重，E 品種發(fā)病輕，D 品種正常。在所有種雞發(fā)病案例中，均為母系發(fā)病，父系正常。

3.6.2 高發(fā)日齡 發(fā)病階段集中在育成中后期（7～20 周）、產(chǎn)蛋上升期（20～35 周），個(gè)別高峰期后也偶有發(fā)病。

3.6.3 發(fā)病區(qū)域及季節(jié) 發(fā)病無(wú)地域差別；該病無(wú)明顯季節(jié)性，全年均可發(fā)病，其中在秋冬或春秋季節(jié)因應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)病率相對(duì)較高。

3.6.4 其他情況 高強(qiáng)度免疫（特別是菌苗免疫）、產(chǎn)前加光等應(yīng)激因素可加重或促進(jìn)發(fā)病。

4 討論

國(guó)外很早就有關(guān)于雞肝臟問(wèn)題的報(bào)道，Nesheim 等[10-11]在1970 年前后通過(guò)對(duì)39 例雞脂肪肝出血綜合征（FLHS）病雞進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)11 只母雞是同一公雞的后代，證明了該病具有很強(qiáng)的遺傳相關(guān)性。Carlich 等[12]對(duì)在相同條件下飼養(yǎng)的雞群隨機(jī)取樣并進(jìn)行脂肪肝含量分析發(fā)現(xiàn)，脂肪肝含量因雞的品種、品系不同而有很大差異。以上研究表明，F(xiàn)LHS 具有遺傳性。本研究通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)雞肝破裂血水綜合征發(fā)生區(qū)域廣、損失大，與特定品種和品系存在相關(guān)性，同一雞場(chǎng)飼養(yǎng)不同品種，在條件相同的情況下，有的品種發(fā)病，有的不發(fā)病。另外與品系也有相關(guān)性，同一來(lái)源品種出現(xiàn)母系發(fā)病，父系正常，祖代也出現(xiàn)肝破裂情況，多表現(xiàn)在D 系慢羽，其他A、B、C正常，D 系快羽也輕，反映到下游父母代具有一致相關(guān)性。通過(guò)上游了解與種源換羽無(wú)相關(guān)性，也不存在四系配套混亂情況。

應(yīng)激因素可以加重雞的肝臟疾病。相關(guān)研究[1，13-15]表明：油苗免疫期尤其是細(xì)菌苗的免疫對(duì)雞體刺激非常大，常常引起肝硬化、出血等臨床表現(xiàn)；在流行病學(xué)調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一些肝破裂出血病例雞群往往在免疫滅活苗后發(fā)生，其嚴(yán)重程度要比未免疫雞群高，死亡率上升明顯。

相關(guān)研究[16-19]表明，HEV、空腸彎曲桿菌、ALV、FAdV 等病原可以引起雞肝臟的一系列病理變化。本研究中部分樣品零星檢測(cè)到HEV、FADV等相關(guān)病原，但病原檢測(cè)不具有一致性，而且通過(guò)臨床診斷與肝破裂出血沒(méi)有直接相關(guān)性；部分樣品檢測(cè)到大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌，通過(guò)臨床判斷為應(yīng)激條件下激發(fā)所致，與肝破裂出血沒(méi)有直接相關(guān)性；內(nèi)毒素檢測(cè)有少部分超標(biāo)，且超標(biāo)樣品臨床有細(xì)菌感染，內(nèi)毒素與肝破裂出血沒(méi)有直接相關(guān)性；病理診斷顯示部分樣品有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病變，但核酸檢測(cè)和病毒培養(yǎng)均未有檢出。另外在病理切片觀察中，93.94%樣本均有淀粉樣和纖維樣滲出，提示雞體出現(xiàn)炎性反應(yīng)過(guò)度。

臨床發(fā)生肝破裂血水綜合征，首先以肉種雞特定品種為主，逐漸過(guò)渡到蛋雞品系，流行范圍廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、所涉品種多，全國(guó)不同實(shí)驗(yàn)室廣泛采樣、利用不同檢測(cè)方法等均無(wú)特定病原檢出，提示造成此次肝破裂血水綜合征的原發(fā)病原可能為非傳染性因素；疫病流行期間國(guó)內(nèi)種源相對(duì)匱乏且疫苗免疫頻次繁多，加速了肝破裂血水臨床表征出現(xiàn)，造成此疫病為傳染性病原的假象。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)結(jié)果并結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，初步認(rèn)為是機(jī)體本身存在遺傳性自身免疫性疾病，造成機(jī)體反應(yīng)過(guò)度，出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征導(dǎo)致雞肝臟淀粉樣出血。該病主要由外源性物質(zhì)（病原性與物理性病因）致機(jī)體發(fā)生持續(xù)性慢性炎癥，從而導(dǎo)致過(guò)多酶解形成的錯(cuò)誤折疊蛋白鏈凝集成不溶性纖絲。這種分子構(gòu)成使淀粉樣蛋白極度不溶，并幾乎可完全抵抗蛋白酶作用，因而淀粉樣蛋白一旦在細(xì)胞和組織中沉積就幾乎不可能清除，淀粉樣浸潤(rùn)最后導(dǎo)致細(xì)胞消亡和組織破壞、死亡[20]，最后使得肝細(xì)胞產(chǎn)生淀粉樣蛋白，肝臟堆積而使肝臟形態(tài)與功能受損，肝臟內(nèi)堆積的淀粉樣蛋白纖維原一旦形成很難被消除，從而導(dǎo)致肝臟破裂出血。

目前對(duì)該病尚無(wú)有效解決方案。最重要的方式是引種時(shí)選擇優(yōu)良品種，其次是減少應(yīng)激。特別要加強(qiáng)疫苗免疫操作的規(guī)范性，尤其注意油乳劑疫苗的預(yù)溫和搖勻；科學(xué)設(shè)計(jì)免疫程序，避免大劑量、多種疫苗同時(shí)或免疫間隔過(guò)短；最后注意開產(chǎn)前減少多重應(yīng)激，加光時(shí)避免其他應(yīng)激因素等。