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    BRCA1基因miRNA結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性與肝細(xì)胞癌術(shù)后總生存期的關(guān)聯(lián)研究

    2021-05-11 06:33:28林秋伶劉穎春溫秋萍周子寒蔣燕霽梁秀妹龔文鋒馬良劉書言余紅平
    中國癌癥防治雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:同源基因型位點(diǎn)

    林秋伶 劉穎春 溫秋萍 周子寒 蔣燕霽 梁秀妹 龔文鋒 馬良 劉書言 余紅平

    肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,2018年中國肝癌新發(fā)病例約41萬例,位居惡性腫瘤發(fā)病譜第5位;肝癌相關(guān)死亡人數(shù)約39.1萬例,位居惡性腫瘤死亡譜第2位[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最主要的病理分型,占我國所有肝癌患者的90%[2]。近年來盡管肝癌的治療水平有了很大提高,但5年生存率仍不理想[3?4]。據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計(jì),HCC患者的5年總生存率僅為12.1%[5]。導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的危險因素除了臨床分期、微血管侵犯、癌栓、甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)等因素外,個體的遺傳變異也可能影響HCC患者的預(yù)后[6]。因此,探索遺傳變異對HCC預(yù)后的影響,對患者的個體化治療和預(yù)后改善具有重要意義。

    MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA,通過與信使RNA非翻譯區(qū)(3'?UTR)中的靶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而調(diào)控基因的表達(dá)[7]。位于miRNA結(jié)合位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)可通過影響miRNA對靶基因的調(diào)控作用,改變靶基因轉(zhuǎn)錄水平或功能,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[8]。研究證實(shí),位于功能基因的miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNP在癌癥發(fā)病風(fēng)險和預(yù)后中起著重要作用[9?10]。YU等[11]研究發(fā)現(xiàn)FAM13A基因SNP rs9224(G>A)與肺鱗癌預(yù)后相關(guān),A等位基因可能通過影響FAM13A基因和miRNA?22?5p的結(jié)合能力而增加肺鱗癌的死亡風(fēng)險。ZHANG等[12]報道攜帶MDM4 rs4245739(A>C)AC/CC基因型的口咽癌患者較攜帶AA基因型患者的總生存率和無病生存率顯著提高。ZHOU等[13]發(fā)現(xiàn)GOLGA7 rs11337(G>T)可能與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有關(guān),攜帶GT基因型患者的死亡風(fēng)險高于攜帶GG基因型患者(HR=1.25,95%CI:1.04~1.50)。

    DNA損傷可由各種內(nèi)源性和外源性刺激引起[14],通過損傷修復(fù)反應(yīng)維持基因組完整性[15]。同源重組是DNA修復(fù)主要途徑之一,在DNA復(fù)制和DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)中起重要作用[16]。BRCA1 DNA修復(fù)相關(guān)基因(BRCA1 DNA repair associated,BRCA1)位于17q21.31號染色體上,在同源重組過程中起關(guān)鍵作用[17?18]。BRCA1表達(dá)水平的下調(diào),降低了DNA修復(fù)能力,可增加癌細(xì)胞對包括化療和放療在內(nèi)的DNA損傷因子的敏感性[19]。已有研究表明BRCA1高表達(dá)與多種腫瘤不良預(yù)后相關(guān),包括卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等[20?22]。DNA修復(fù)相關(guān)基因的遺傳變異,不僅影響癌癥發(fā)病風(fēng)險,還影響患者的治療反應(yīng),導(dǎo)致復(fù)發(fā)和生存時間的差異[23]。本研究主要探討B(tài)RCA1 miRNA結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性與HCC患者術(shù)后總生存期(overall survival,OS)的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    本研究基于本課題組肝癌分子流行病學(xué)遺傳變異數(shù)據(jù)庫中接受根治術(shù)治療的411例HCC患者為研究對象,來源于2004年6月至2013年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院首次確診且接受根治性手術(shù)切除的HCC患者,均經(jīng)術(shù)后病理診斷或結(jié)合影像學(xué)及AFP等指標(biāo)診斷為HCC。排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者;合并嚴(yán)重心臟、肺臟、腎臟以及腦血管疾病患者;拒絕隨訪或無完整的臨床資料患者;術(shù)前曾接受放射治療和/或化療患者。本研究通過廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批,且經(jīng)研究對象知情同意。

    1.2 資料收集與隨訪

    通過電話進(jìn)行隨訪。查閱病歷收集患者性別、年齡、飲酒史、吸煙史以及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染情況、BCLC分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否合并肝硬化、有無癌栓等資料?;颊叱鲈汉?年內(nèi)每3個月電話隨訪1次,之后每6個月隨訪1次,隨訪截至2020年2月24日。以O(shè)S作為終點(diǎn)指標(biāo),OS為手術(shù)之日至患者死亡或末次隨訪的時間。失訪或末次隨訪仍未死亡的病例作為截尾事件。

    1.3 SNPs的選擇和基因分型

    1.3.1 BRCA1候選SNPs的選擇 基于SNP功能預(yù)測網(wǎng)站(http://snpinfo.niehs.nih)篩選位于 BRCA1 miRNA結(jié)合位點(diǎn)上的SNPs。選擇標(biāo)準(zhǔn):⑴位于miRNA結(jié)合位點(diǎn)上;⑵在中國北京漢族人群中最小等位基因頻率>0.05。最終篩選到SNPs rs8176318和rs12516,這2個SNPs均位于miRNA結(jié)合位點(diǎn)且完全連鎖(r2=1)。本研究選擇BRCA1的rs8176318(C>A)進(jìn)行研究。

    1.3.2 基因型檢測和質(zhì)量控制 采用苯酚?氯仿法從血液中提取DNA。SNP rs8176318(C>A)使用Agena Mass ARRAY分型系統(tǒng)(Agena;San Diego,California)進(jìn)行基因分型檢測。BRCA1 rs8176318位點(diǎn)PCR引物設(shè)計(jì):上游序列為5'?ACGTTGGATGTCCTTCCATT?GAAGGGTCTG?3',下游序列為5'?ACGTTGGATGTG?GCCTCAAGAGAATAGCTG?3'?;蚍中统晒β蕿?3.2%;隨機(jī)抽取10%樣品進(jìn)行復(fù)檢,復(fù)檢一致率為100%。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    以乘積極限法(Kaplan?Meier)進(jìn)行單因素分析,log?rank法比較攜帶不同基因型患者術(shù)后OS的差異,并使用GraphPad Prism 7.0軟件(GraphPad Software Inc,San Diego,CA,USA)繪制生存曲線。采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素和多因素Cox比例風(fēng)險模型分析,計(jì)算風(fēng)險比(hazard rate,HR)和95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)。表達(dá)數(shù)量性狀基因座分析(expressionquantitativetraitloci,eQTL)數(shù)據(jù)來源于GTEx數(shù)據(jù)庫(GTEx,V7,http://www.gtexportal.org/home/)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 研究人群基本特征

    本研究剔除基因分型失敗的28例和OS<30 d的20例HCC患者,最終納入363例HCC患者進(jìn)行生存分析,隨訪截止時,截尾數(shù)據(jù)97例(26.7%),其中失訪66例(18.2%)?;颊叩娜丝趯W(xué)和臨床病理特征分布(表1):男性331例(91.18%),女性32例(8.82%);吸煙者151例(41.6%),飲酒者134例(36.91%);HBV感染者311例(85.67%);BCLC分期A/B期201例(55.37%),BCLC分期C期162例(44.63%);單個腫瘤285例(78.51%);腫瘤直徑>5 cm 230例(63.36%);合并肝硬化201例(55.37%);發(fā)生癌栓98例(23.00%)。Cox比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果顯示,腫瘤直徑>5 cm(HR=1.883,95%CI:1.441~2.462,P<0.001)和發(fā)生癌栓(HR=1.900,95%CI:1.443~2.503,P<0.001)的患者死亡風(fēng)險更高。

    表1 363例HCC術(shù)后患者臨床病理特征與OS的關(guān)系Tab.1 Association between clinicopathological characteristics and OS in 363 HCC patients after hepatectomy

    2.2 BRCA1 rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系

    使用多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析在不同遺傳模型中rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性。在共顯性模型下,調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染情況、BCLC分期、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、肝硬化、癌栓等因素后,發(fā)現(xiàn)攜帶突變純合子AA基因型的HCC患者術(shù)后發(fā)生死亡的風(fēng)險降低了30.3%(HR=0.697,95%CI:0.493~0.984,P=0.040);在隱性模型(AAvsCC/AC)下,攜帶AA基因型的患者較CC/AC基因型患者術(shù)后發(fā)生死亡的風(fēng)險降低了32.5%(HR=0.675,95%CI:0.494~0.922,P=0.014),見表2。Kaplan?Meier分析結(jié)果顯示,攜帶AA基因型的HCC患者較攜帶AC/CC基因型患者術(shù)后中位OS更長(46.1個月vs33.8個月,P=0.049),見圖1。

    表2 BRCA1 rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的關(guān)系Tab.2 Association between BRCA1 rs8176318 and OS in HCC patients after hepatectomy

    圖1 rs8176318 HCC位點(diǎn)不同基因型 術(shù)后患者的生存曲線Fig.1 Survival curves for HCC patients after hepatectomy by rs8176318 genotypes

    2.3 分層分析rs8176318對HCC患者術(shù)后OS的影響

    在年齡、腫瘤大小、癌栓和肝硬化分層下,rs8176318與HCC患者術(shù)后OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P>0.05)。而在男性人群中,攜帶rs8176318位點(diǎn)AA基因型的患者較CC/CA基因型患者術(shù)后死亡風(fēng)險顯著降低(HR=0.616,95%CI:0.443~0.856,P=0.004);在飲酒人群中,攜帶AA基因型較攜帶CC/CA基因型患者術(shù)后死亡風(fēng)險顯著降低(HR=0.670,95%CI:0.454~0.988,P=0.043);在不吸煙人群中,攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風(fēng)險(HR=0.616,95%CI:0.417~0.911,P=0.015);在HBV感染人群中,攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風(fēng)險(HR=0.664,95%CI:0.466~0.945,P=0.023);在BCLC分期A/B期人群中,攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風(fēng)險(HR=0.632,95%CI:0.419~0.952,P=0.028);在單個腫瘤人群中,攜帶AA基因型的患者比攜帶CC/CA基因型患者具有更低的死亡風(fēng)險(HR=0.694,95%CI:0.491~0.981,P=0.038)。見表3。

    表3 分層分析rs8176318與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性Tab.3 Stratification analyses of association between rs8176318and OS in HCC patients after hepatectomy

    2.4 rs8176318不同基因型與BRCA1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

    為評估rs8176318不同基因型與BRCA1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性,本研究利用GTEx數(shù)據(jù)庫中208例正常肝臟組織的 R NA?Seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行 e QTL分析。eQTL結(jié)果顯示,rs8176318 AA基因型與較低的BRCA1 mRNA表達(dá)水平相關(guān)(P<0.001),見圖2。

    圖2 rs8176318基因型與BRCA1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析Fig.2 The correlation between BRCA1 rs8176318 genotypes and its mRNA expression levels

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn)BRCA1基因miRNA結(jié)合位點(diǎn)上的rs8176318多態(tài)性與HCC患者術(shù)后OS相關(guān),A等位基因可降低HCC患者術(shù)后死亡風(fēng)險且rs8176318 AA基因型與較低的BRCA1 mRNA表達(dá)水平相關(guān)。這表明rs8176318可能通過影響B(tài)RCA1的轉(zhuǎn)錄水平從而影響HCC患者預(yù)后,可作為判斷HCC預(yù)后的生物標(biāo)志物。

    BRCA1是一個重要的DNA修復(fù)基因,主要參與機(jī)體的DNA同源重組修復(fù)。首先,BRCA1通過與abraxas?RAP80復(fù)合物結(jié)合從而被吸附到DNA雙鏈斷裂處[24];接著,通過與CtIP和MRN復(fù)合體的交互作用參與DNA雙鏈斷裂切除[25?26];最后,將RAD51募集到DNA損傷位點(diǎn)與PALB2和BRCA2等基因發(fā)生相互作用,從而完成同源重組修復(fù),維持機(jī)體基因組的穩(wěn)定性[27]。目前研究表明,BRCA1 DNA修復(fù)基因在腫瘤進(jìn)展和治療中發(fā)揮著雙刃劍的作用。一方面,在正常細(xì)胞內(nèi),DNA修復(fù)相關(guān)基因可以通過基因修復(fù)幫助細(xì)胞抵抗自發(fā)或誘導(dǎo)的DNA損傷,抑制惡性腫瘤發(fā)生[28]。另一方面,在腫瘤細(xì)胞內(nèi),腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)DNA損傷的修復(fù)能力來逃逸細(xì)胞死亡,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放化療藥物的耐受性[29]。有研究[30]發(fā)現(xiàn)miR?NA?140過表達(dá)可以靶向抑制腫瘤細(xì)胞中DNA修復(fù)基因FEN1的表達(dá),顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。亦有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)EN1高表達(dá)水平與多種癌癥耐藥和預(yù)后不良有關(guān)[31?32]。ZHAO等[33]研究表明BRCA1表達(dá)水平下調(diào)可導(dǎo)致HCC細(xì)胞的同源重組修復(fù)能力下降,同時PARP1表達(dá)水平下調(diào)可導(dǎo)致HCC細(xì)胞的堿基切除修復(fù)能力缺失,兩者發(fā)揮協(xié)同作用可造成HCC細(xì)胞不可修復(fù)的DNA損傷和細(xì)胞死亡,從而提高HCC細(xì)胞對化療藥物奧拉帕尼的敏感性。WANG等[34]發(fā)現(xiàn)小分子藥物奧拉帕尼可阻斷HCC細(xì)胞的同源重組修復(fù)和選擇性非同源末端連接修復(fù),而DNA?PK抑制劑能阻斷HCC細(xì)胞的非同源末端連接修復(fù),奧拉帕尼和DNA?PK抑制劑聯(lián)合使用可以完全阻斷HCC細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力,進(jìn)而有效抑制HCC細(xì)胞增殖,腫瘤增長抑制率達(dá)到62.3%~83.9%。PARK等[35]研究表明乳腺癌中BRCA1蛋白過表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)。

    目前越來越多的證據(jù)表明,miRNAs可能通過影響B(tài)RCA1轉(zhuǎn)錄水平參與DNA損傷修復(fù)過程,從而正確調(diào)控細(xì)胞周期和維持基因組穩(wěn)定性[36]。但是很少研究關(guān)注BRCA1基因miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNP在腫瘤預(yù)后中的作用。泰國一項(xiàng)針對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌復(fù)發(fā)率降低與BRCA13'?UTR上SNPs 5711+421(G>T)和5711+1286(C>T)相關(guān)[37]。ZHU 等[38]研究也發(fā)現(xiàn)在口咽鱗狀細(xì)胞癌中位于BRCA1 miRNA結(jié)合位點(diǎn)上SNP rs12516(T>C)的CC基因型可降低患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)BRCA1 SNP rs8176318可影響HCC患者術(shù)后OS,AA基因型可降低患者的死亡風(fēng)險。

    miRNAs結(jié)合位點(diǎn)上的SNPs可能通過影響miRNA和靶基因的結(jié)合能力改變基因轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致基因部分功能改變[39]。本研究基于SNPinfo網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn),BRCA1 SNP rs8176318可能存在5個靶向結(jié)合miRNAs(has?miR?1182、has?miR?149、has?miR?345、has?miR?544和has?miR?639)。其中,has?miR?149被普遍認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子[40],也是良好的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物[41]。ZHANG等[42]研究發(fā)現(xiàn)has?miR?149在HCC組織中的表達(dá)明顯下調(diào),且其低表達(dá)與較差的臨床病理特征相關(guān)(包括腫瘤體積大、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更晚的BCLC分期)。LUO等[43]發(fā)現(xiàn)干擾has?miR?149后,HCC細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯增強(qiáng),而且其低表達(dá)是HCC預(yù)后不良的影響因素。也有研究發(fā)現(xiàn)干擾has?miR?345后,HCC細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力均明顯增強(qiáng),而且其低表達(dá)與HCC預(yù)后不良有關(guān)[44?45]。本研究的基因型?表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,rs8176318AA基因型與較低的BRCA1 mRNA表達(dá)水平相關(guān),因此推測rs8176318突變純合基因型AA可能通過提高miRNA與BRCA1的結(jié)合能力而抑制BRCA1 mRNA的表達(dá)水平,致使HCC細(xì)胞的同源重組修復(fù)能力下降,進(jìn)而降低HCC患者術(shù)后的死亡風(fēng)險,但是這一推測還需進(jìn)一步進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    綜上所述,BRCA1 rs8176318(C>A)AA可能通過提高miRNA與BRCA1的結(jié)合能力而抑制BRCA1 mRNA的表達(dá)水平,致使HCC細(xì)胞的同源重組修復(fù)能力下降,進(jìn)而降低HCC患者術(shù)后的死亡風(fēng)險。但本研究也存在一定的局限性:⑴本課題是以醫(yī)院為基礎(chǔ)的回顧性隊(duì)列研究,病例納入可能會存在入院偏倚;⑵樣本量相對較小;⑶未能收集更完整的臨床治療數(shù)據(jù),比如患者術(shù)后接受輔助性治療等信息,未能對這些因素進(jìn)行評估,可能對最終的研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此,本研究結(jié)果仍需開展更大樣本量的多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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