青稞膳食纖維和多酚對(duì)腸道微生物的協(xié)同調(diào)節(jié)作用

魯朝鳳,黃佳琦,黃勇樺,楊士花,陳壁,楊明靜,李永強(qiáng)*

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明, 650201)2 (杭州漢庫醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司, 浙江 杭州, 310000) 3(滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 普洱茶學(xué)院, 云南 普洱, 665099)4 (云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 外語學(xué)院, 云南 昆明, 650201)

腸道微生物群是一個(gè)復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，大約有1014個(gè)細(xì)菌組成，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和放線菌門[1-3]。腸道微生物群能夠參與體內(nèi)難消化碳水化合物等成分的代謝[4-5]，同時(shí)能夠與宿主腸道系統(tǒng)相互作用，保障黏液層結(jié)構(gòu)的完整，阻止病原菌在宿主腸道內(nèi)的定植[6]。腸道微生物群失衡可以引發(fā)炎癥性腸病、癌癥、肥胖和代謝綜合征等慢性疾病[2]。因此，維持腸道微生物群的平衡與人體健康密切相關(guān)。然而，單純攝入含有乳酸菌、雙歧桿菌和乳球菌等益生菌制劑，一方面在體內(nèi)停留時(shí)間較短，僅為14 d，沒有發(fā)揮益生作用；另一方面腸道黏膜菌群對(duì)益生菌產(chǎn)生定植抵抗，引起腸道微生物群的失衡[7-8]。所以，合理膳食能夠調(diào)節(jié)腸道微生物組成，維持腸道微生物群平衡[9]。

膳食纖維在小腸中難以消化和吸收，可以到達(dá)結(jié)腸，并與微生物群相互作用，能夠促進(jìn)有益菌生長，抑制有害菌繁殖，調(diào)節(jié)腸道微生物組成[10]，具有預(yù)防肥胖、降低代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)的作用[11-12]。多酚化合物的生物有效性和生物利用度較低，90%～95%在小腸中不能被消化和吸收，到達(dá)結(jié)腸后能夠與腸道微生物相互作用，調(diào)節(jié)腸道微生物群，維持腸道微生物群落平衡[9]。研究表明，多酚化合物能夠促進(jìn)乳桿菌等有益菌生長，抑制致病菌生長[3]，降低厚壁菌門(Phylum Firmicutes)和擬桿菌門(Phylum Bacteroidetes)的比例，修復(fù)腸道微生物失調(diào)，緩解高膽固醇血癥[2,12]，預(yù)防肥胖等慢性疾病[11]。

膳食纖維和多酚均能改變腸道微生物群的組成和結(jié)構(gòu)，保持腸道微生物菌群的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)人體健康。青稞(HordeumvulgareL.var.nudumhook.f.)作為云南省迪慶藏族自治州高原特色谷物[10]，含有豐富的多酚和膳食纖維[13]。目前關(guān)于膳食纖維和多酚協(xié)同調(diào)節(jié)腸道微生物的研究鮮有報(bào)道，因此本研究提取青稞中不可溶膳食纖維-多酚(insoluble dietary fiber-phenolic compounds，IDF-PC)和可溶性膳食纖維-多酚(soluble dietary fiber-phenolic compounds，SDF-PC)，利用體外結(jié)腸發(fā)酵，通過16S rRNA高通量測(cè)序，研究膳食纖維和多酚對(duì)腸道微生物的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，以期為青稞促進(jìn)機(jī)體健康和預(yù)防疾病提供科學(xué)依據(jù)，為青稞深加工提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云黑青稞由云南省迪慶藏族自治州農(nóng)科所提供。2-(N-嗎啉)乙磺酸-水合物(MES monohydrate)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，北京索萊寶科技有限公司；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品、耐高溫α-淀粉酶、堿性蛋白酶、糖化酶、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海晶純生化科技股份有限公司；福林-酚試劑、豬α-淀粉酶、豬胃蛋白酶、豬膽汁鹽、豬胰液素、豬黏液素，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋和去氧劑，三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-304不銹鋼五谷雜糧磨粉機(jī)，廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司；TGL20M離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV-1800CP紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市城西麗華實(shí)驗(yàn)儀器廠；ZD-85A雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司；L6J-12冷凍干燥機(jī)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膳食纖維-多酚復(fù)合物的制備

參考LEE[14]和李永強(qiáng)等[15]的方法。準(zhǔn)確稱取100 g青稞面粉(hulless barley powder，HBF)，取1 500 mL MES-Tris緩沖液溶解，加入耐高溫α-淀粉酶，酶解后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至10.5，加入堿性蛋白酶，反應(yīng)后用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.25，加入糖化酶酶解。酶解結(jié)束后，離心，棕色沉淀為IDF-PC，收集合并后凍干，于-80 ℃避光保存。離心后上清液加入乙醇溶液，靜置過夜，離心后所得白色沉淀為SDF-PC，收集合并后凍干，于-80 ℃避光保存。

1.3.2 多酚化合物及膳食纖維含量測(cè)定

1.3.2.1 可溶性和不可溶鍵合多酚的提取

按LI等[16-18]的方法提取多酚化合物。分別稱取HBF、IDF-PC、SDF-PC各2 g，加入70%(體積分?jǐn)?shù))丙酮溶液，室溫超聲提取，離心后得上清液，重復(fù)3次。合并上清液，30 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇溶解得可溶性多酚化合物。離心殘?jiān)尤隢aOH，室溫水解4 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，離心，上清液用乙醚和乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇溶解得不可溶鍵合多酚化合物，于4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 多酚含量測(cè)定

采用福林-酚試劑比色法[16-18]測(cè)定樣品中可溶性和不可溶鍵合多酚含量。以阿魏酸制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=1.289x-0.003 (R2=0.998)，所得結(jié)果用阿魏酸當(dāng)量(ferulic acid equivalents，F(xiàn)AE)表示，結(jié)果表示為μmol FAE/g 干樣(dry sample,DS)。樣品總多酚含量為可溶性和不可溶鍵合多酚含量之和。

1.3.2.3 膳食纖維含量測(cè)定

據(jù)1.3.1中的方法制備膳食纖維多酚復(fù)合物，得到膳食纖維-多酚(dietary fibber-phenolic compounds，DC-PC)，并計(jì)算HBF中膳食纖維含量。IDF-PC、SDF-PC中膳食纖維含量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1，樣品質(zhì)量,g；m2，多酚質(zhì)量,g。

1.3.3 體外結(jié)腸發(fā)酵

根據(jù)ANOMA等[17-19]方法制備胃腸殘?jiān)?。分別稱取一定量HBF，SDF-PC，IDF-PC，加入蒸餾水和NaCl溶液，于37 ℃水浴，定期振搖使樣品溫度達(dá)37 ℃。加入豬α-淀粉酶水浴消化后，利用HCl調(diào)節(jié)pH值至2，然后加入豬胃蛋白酶，暗處消化2 h，得到模擬胃消化產(chǎn)物懸濁液。用NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5，依次加入膽汁鹽，豬胰液素，豬黏液素進(jìn)行消化。然后樣品離心得到上清液和殘?jiān)瑲堅(jiān)尤胝麴s水后再次離心，合并上清液，殘?jiān)鼉龈捎糜诮Y(jié)腸發(fā)酵。

將糞便樣品用磷酸緩沖溶液稀釋并過濾，以過濾的渾濁液作為接種物。配制培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌15 min，加入凍干的胃腸殘?jiān)湍c道微生物渾濁液，分別培養(yǎng)5、10、24、48 h。設(shè)置HBF、IDF-PC和SDF-PC 樣品組，阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)對(duì)照組和空白組(blank，B)。HBF組為糞便+HBF+培養(yǎng)基；IDF-PC組為糞便+培養(yǎng)基+IDF-PC；SDF-PC組為糞便+培養(yǎng)基+SDF-PC；FA組為糞便+培養(yǎng)基+FA；B組為豬糞便。發(fā)酵結(jié)束后，離心后得到的殘?jiān)糜诜治鑫⑸锒鄻有浴?/p>

1.3.4 短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)分析

根據(jù)PARKAR等[20]的方法提取SCFAs并測(cè)定含量，結(jié)腸發(fā)酵樣品離心后取上清液，加入NaCl、偏磷酸、CuSO4，渦旋混勻后，用乙醚提取，然后離心，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中。加入NaOH溶液，振搖提取10 min，離心后，水相移到玻璃瓶中，加入磷酸溶液混勻，用于液相分析。

用島津高效液相色譜儀SPD-20A，島津色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在40 ℃下進(jìn)行分離，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min，波長為214 nm，流動(dòng)相：A為甲醇，C為磷酸氫二銨溶液(1.5 g加入600 mL超純水溶解，用1 mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.78)，條件為：0 min，A∶C(0∶100)；7 min，A∶C(5∶95)；15 min，A∶C(40∶60)；24 min，A∶C(40∶60)；25 min，A∶C(0∶100)；35 min，A∶C(停止)。

1.3.5 微生物16S rRNA測(cè)序

16S rRNA測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。DNA的提取根據(jù)OMEGA-soil DNA Kit試劑盒說明書的方法進(jìn)行提取。利用NanoDrop2000檢測(cè)DNA純度，利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。擴(kuò)增樣品中的16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)，引物為：338F和806R。PCR(ABI GeneAmp?9700型)采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μmol/L)和Reverse Primer(5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，ddH2O 11.79 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。采用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，用Tris-HCl洗脫。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。進(jìn)行Miseq文庫構(gòu)建，在Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.6 腸道微生物生物信息學(xué)分析

Miseq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成1條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。使用Trimmomatic軟件進(jìn)行去雜，過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基。在97%的序列相似度水平上，使用Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse)軟件對(duì)所有序列進(jìn)行可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類分析。參考數(shù)據(jù)庫為Silva (Release123 http://www.arb-silva.de)[21]，利用RDP classifier貝葉斯算法[22]對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，通過對(duì)比Silva[23]數(shù)據(jù)庫(Release119 http://www.arb-silva.de)；在門水平和屬水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。細(xì)菌群落組成采用直觀的柱狀圖呈現(xiàn)，樣品中分類水平未被命名的種類命名為“others”。用mothur軟件計(jì)算樣品的α多樣性指數(shù)。

根據(jù)β多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類分析，使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)。通過主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)樣本微生物群落組成差異性或相似性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0中的單因素方差進(jìn)行分析，表中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)顯著性利用Tukey test(P<0.05)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚及膳食纖維含量

HBF、IDF-PC、SDF-PC中多酚和膳食纖維含量見表1，3種樣品中總多酚含量和膳食纖維含量差異顯著(P<0.05)。HBF與IDF-PC和SDF-PC相比，HBF總多酚含量最高，為26.90 μmol FAE/g DS，其次是IDF-PC、SDF-PC，分別為24.45、7.54 μmol FAE/g DS；3種樣品中，SDF-PC膳食纖維含量最高，其次為HBF和IDF-PC，分別為99.85%、99.53%、30.76%。

表1 三種樣品中總多酚含量和膳食纖維含量Table 1 The total phenolic and dietary fiber content of three samples

2.2 16S rRNA分析微生物的組成

2.2.1 腸道微生物多樣性分析

使用the Good′s coverage指數(shù)來分析樣品的測(cè)序覆蓋率，HBF、IDF-PC、SDF-PC樣品組，空白組B和對(duì)照組FA的測(cè)序覆蓋深度均大于99.56%，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

α多樣性分析主要通過豐度指數(shù)(Ace指數(shù)、Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))來進(jìn)行表征，結(jié)果見表2，4種樣品經(jīng)結(jié)腸發(fā)酵后，在前24 h，Ace和Chao1指數(shù)呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.05)，說明微生物的豐度均呈下降趨勢(shì)，可能由于前24 h多酚對(duì)腸道微生物的抑制起主要作用，導(dǎo)致微生物數(shù)量下降；24 h后，Ace和Chao1指數(shù)變化不明顯，說明微生物豐度差異不大，可能由于多酚和膳食纖維的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致微生物生長趨于平衡。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈先下降后上升趨勢(shì)，可能由于發(fā)酵前期多酚對(duì)微生物的抑制起主導(dǎo)作用，導(dǎo)致微生物多樣性指數(shù)降低，發(fā)酵后期膳食纖維促進(jìn)了微生物的生長，導(dǎo)致微生物多樣性指數(shù)升高。HBF、IDF-PC和SDF-PC發(fā)酵48 h后，Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)高于FA對(duì)照組，但Simpson指數(shù)變化無明顯差異，說明膳食纖維多酚對(duì)腸道微生物的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于單一多酚。

HUANG等[24]通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兒茶素、槲皮素和葛根素能夠降低腸道微生物多樣性，與本研究結(jié)果一致。WANG等[11]利用SDF喂養(yǎng)肥胖小鼠，增加了小鼠腸道微生物的α-多樣性，本研究結(jié)果與其相反，可能是因?yàn)槎喾雍蜕攀忱w維協(xié)同調(diào)節(jié)作用。

表2 不同樣品的豐度和多樣性Table 2 Abundance and diversity of different samples

β多樣性主要利用PCoA進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示，在5、10 h時(shí)，HBF和IDF-PC組相距較近，說明HBF和IDF-PC組的微生物組成較為相似。在24 h時(shí)，HBF和SDF-PC組樣本混合在一起，說明此時(shí)HBF和SDF-PC組的微生物組成相似度較高，而IDF-PC和FA組則相互分開，與其他樣本相似度較低。在48 h時(shí)，HBF、IDF-PC和FA組彼此之間分離，而SDF-PC間則較為分散，說明此時(shí)各組的微生物組成相似度較低。結(jié)腸發(fā)酵5 h時(shí)，不同樣品之間清晰分離，說明此時(shí)樣品對(duì)腸道微生物的調(diào)節(jié)作用最好。結(jié)合圖3屬水平微生物組成分析可知，3種樣品對(duì)有益菌的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于FA，進(jìn)一步說明了膳食纖維和多酚的協(xié)同調(diào)節(jié)作用優(yōu)于單一多酚。

2.2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

門水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析如圖2所示，HBF、IDF-PC和SDF-PC樣品組、B組和FA對(duì)照組中主要的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等。LIU等[25]利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外結(jié)腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究多酚及膳食纖維對(duì)腸道微生物的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，與本研究結(jié)果相似。

圖1 基于OTU豐度的PCoA主坐標(biāo)分析Fig.1 PCoA based on OTU abundance注：F-5、F-10、F-24、F-48、H-5、H-10、H-24、H-48，I-5、I-10、I-24、I-48，S-5、S-10、S-24、S-48分別表示FA，HBF，IDF-PC和SDF-PC發(fā)酵5、10、24、48 h

研究表明，厚壁菌門/擬桿菌門比例與體重呈正相關(guān)[13,26]。由圖2可知，HBF、IDF-PC、SDF-PC樣品組和FA對(duì)照組經(jīng)結(jié)腸發(fā)酵后，腸道微生物菌門厚壁菌門/擬桿菌門的比例在5 h時(shí)分別為53.53%、82.39%、96.48%和116.11%；10 h時(shí)分別為35.57%、38.74%、33.86%和125.38%；24 h時(shí)分別為2.95%、6.26%、4.76%和0.75%；48 h時(shí)分別為1.04%、1.74%、3.93%和0.45%，說明隨著發(fā)酵時(shí)間的增加均能夠降低腸道微生物菌門厚壁菌門/擬桿菌門的比例。JIN等[27]發(fā)現(xiàn)利用葡萄籽提取物灌喂小鼠能夠降低腸道微生物中厚壁菌門/擬桿菌門的比例，與本研究結(jié)果一致，說明膳食纖維和多酚能夠降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，有助于預(yù)防肥胖，維持人體健康。

圖2 門水平微生物組成Fig.2 Composition of microbial community at phylum level

屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析見圖3和圖4。由圖3可知，空白組、樣品組與對(duì)照組對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)均具有一定的調(diào)節(jié)作用。與空白組相比，樣品組與對(duì)照組在5、10、24、48 h均抑制了部分微生物的生長，包括考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、擬桿菌目S24-7(Bacteroidales-S24-7-group-norank)、顫螺菌屬(Oscillospira)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae-unclassified)、理研菌屬RC9(Rikenellaceae-RC9-gut-group)、顫桿菌屬(Oscillibacter)、密螺旋體屬2(Treponema-2)、擬桿菌目RF16(Bacteroidales-RF16-group-norank)、普雷沃氏菌科NK3B31(Prevotellaceae-NK3B31-group)和普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae-UCG-003)。對(duì)照組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)擬桿菌目S24-7、顫螺菌屬、理研菌屬RC9的抑制作用大于3種樣品。研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物對(duì)有害腸道細(xì)菌有一定的抑制作用，對(duì)有益腸道細(xì)菌有一定促進(jìn)作用[28]。本研究結(jié)果可能與酚類化合物的抑菌作用有關(guān)。HBF、SDF-PC和IDF-PC之間對(duì)微生物的抑制作用無明顯差異，可能是3種樣品中均含有膳食纖維和多酚，對(duì)微生物具有相似的調(diào)節(jié)作用[2,9]。

與空白組相比，樣品組與對(duì)照組也促進(jìn)了部分微生物的生長。在48 h內(nèi)，樣品組與對(duì)照組均促進(jìn)了乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃菌科UCG-005(Ruminococcaceae-UCG-005)、瘤胃菌科NK4A214 (Ruminococcaceae-NK4A214-group)、艾克曼菌屬(Akkermansia)的生長。乳桿菌作為一種益生菌，能夠改善腸道微生物平衡，緩解結(jié)腸易激綜合征[29]。艾克曼菌屬(Akkermansia)與高脂飲食誘發(fā)的代謝疾病呈負(fù)相關(guān)[1,29]。瘤胃菌科UCG-005和瘤胃菌科NK4A214能夠降解膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸，調(diào)整人體的脂質(zhì)代謝[29]。與對(duì)照組相比，樣品組能夠明顯促進(jìn)乳桿菌屬、瘤胃菌科UCG-005、瘤胃菌科NK4A214-和艾克曼菌屬的生長，說明膳食纖維和多酚能夠促進(jìn)部分有益微生物的生長，且對(duì)微生物的協(xié)同調(diào)節(jié)作用優(yōu)于單一多酚。研究發(fā)現(xiàn)，膳食纖維和多酚可以促進(jìn)乳桿菌屬、艾克曼菌屬、瘤胃菌科UCG-005和瘤胃菌科NK4A214的生長[2,20]，與本研究結(jié)果一致。在3種樣品之間，HBF和IDF-PC對(duì)主要優(yōu)勢(shì)微生物具有相似的調(diào)節(jié)作用，SDF-PC對(duì)微生物的調(diào)節(jié)作用與HBF、IDF-PC差別較大，可能是3種樣品中膳食纖維和多酚的含量與結(jié)構(gòu)存在差異，導(dǎo)致了不同的微生物調(diào)節(jié)作用。

圖3 屬水平的微生物組成Fig.3 Composotion of microbial community at genus level

圖4為豐度前30的OTUs進(jìn)行分層聚類制作的熱圖，圖中色塊顏色代表某一個(gè)屬相對(duì)豐度的大小，每一行代表一種屬水平的微生物名稱，每一列代表一種樣品，能夠直觀的反應(yīng)每組之間屬水平的微生物豐度變化。由圖4可知，與空白組相比，對(duì)照組和樣品組有不同的微生物圖譜，均能夠改變微生物群落組成，對(duì)腸道微生物具有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖4 微生物群落在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.4 The relative abundance of the microorganism community at the taxa level of genus in groups注：圖中僅列出30個(gè)屬

2.3 短鏈脂肪酸分析

SCFAs不僅能夠?yàn)閰捬蹙峁┠芰?，促進(jìn)其生長，還可以降低腸道環(huán)境的pH值，抑制有害菌的生長，調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，從而改善腸道紊亂[30]。同時(shí)SCFAs也可以為腸上皮細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腸黏膜生長，維持腸黏膜屏障的完整性，進(jìn)一步改善腸道功能，促進(jìn)機(jī)體健康[30]。未被上消化道吸收的膳食纖維及多酚，可以在結(jié)腸中被腸道微生物群發(fā)酵，得到SCFAs，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等[31]，其中乙酸、丙酸、丁酸占SCFAs總量的95%以上，且乙酸是腸道中含量最多的SCFAs[32]。SCFAs的主要產(chǎn)生菌是厚壁菌門、擬桿菌門，為人類腸道中含量最豐富的2個(gè)門類[26,33]。厚壁菌門主要產(chǎn)生丁酸，擬桿菌門主要產(chǎn)生乙酸和丙酸[26]。研究表明，葡萄及葡萄酒多酚的攝入可以調(diào)節(jié)微生物產(chǎn)生SCFAs，促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸含量增加[32]。

HBF、IDF-PC和SDF-PC經(jīng)腸道微生物代謝后，產(chǎn)生的3種SCFAs見表3，在3種樣品中乙酸是主要短鏈脂肪酸，顯著高于丙酸和丁酸(P<0.05)，含量分別為(0.29±0.21)、(0.15±0.05)和(0.14±0.10)mg/mL。HBF中乙酸和丁酸含量顯著高于IDF-PC和SDF-PC(P<0.05)，分別為(0.29±0.21)和(0.11±0.27)mg/mL，且HBF中的SCFAs含量高于SDF-PC和IDF-PC(P<0.05)，為(0.44±0.2) mg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腸道微生物發(fā)酵后，HBF產(chǎn)生的總SCFAs含量最高，其次是IDF-PC和SDF-PC，與3種樣品中多酚含量變化趨勢(shì)相同(表1)，可能是由于HBF中含有較高的多酚，能夠調(diào)節(jié)腸道微生物，從而生成較多的SCFAs[16]。

表3 短鏈脂肪酸含量 單位：mg/mL

3 結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序方法研究了膳食纖維-多酚復(fù)合物在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中對(duì)腸道微生物的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，HBF、IDF-PC和SDF-PC中均含有較豐富的膳食纖維和多酚。樣品組與對(duì)照組相比，均能夠增加腸道微生物的豐度和多樣性，促進(jìn)有益菌的生長。同時(shí)，能夠降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，具有一定預(yù)防肥胖的作用。3種樣品在腸道微生物的作用下，能夠產(chǎn)生較多的SCFAs，其中乙酸含量最高，說明膳食纖維和多酚對(duì)腸道微生物具有較好的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。本研究為青稞促進(jìn)機(jī)體健康和預(yù)防疾病提供科學(xué)依據(jù)，也為青稞功能食品的開發(fā)提供了新思路。