miR-29a對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制

謝帥　劉欣欣　王曉雪

[摘要]目的研究微小RNA-29a（miR-29a）對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響以及作用機(jī)制。方法不同濃度MPP+（0、100、300、500 μmol/L）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞24 h，熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)miR-29a的表達(dá)量，噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞活力。PC12細(xì)胞分別采用0和500 μmol/L MPP+干預(yù)并轉(zhuǎn)染anti-miR-29a或?qū)φ召|(zhì)粒，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。觀察細(xì)胞活性氧（ROS）水平。TargetScan軟件預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-29a與重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)因子同源框2（TGIF2）的靶向關(guān)系。結(jié)果隨著MPP+濃度的增加miR-29a表達(dá)量隨之增加（F=590.067，P<0.05），而細(xì)胞活力則隨之降低（F=153.561，P<0.05）。下調(diào)miR-29a表達(dá)可抑制PC12細(xì)胞凋亡（F=301.044，P<0.05），降低ROS水平（F=254.120，P<0.05）。TGIF2是miR-29a下游靶基因。結(jié)論miR-29a可能通過(guò)調(diào)控TGIF2抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

[關(guān)鍵詞]帕金森病;微RNAs;PC12細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;TGFB引導(dǎo)因子2

[中圖分類號(hào)]R742.5;R342.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2021）01-0100-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of action of microRNA-29a （miR-29a） on 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）-induced oxidative stress and apoptosis of PC12 cells. MethodsPC12 cells were induced by different concentrations of MPP+ （0，100，300， and 500 μmol/L） for 24 hours， and then quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-29a and MTT assay was used to measure cell viability. PC12 cells were treated with MPP+ （0 and 500 μmol/L） and transfected with anti-miR-29a or control plasmids， and flow cytometry was used to measure the apoptosis rate of the cells. The level of reactive oxygen species （ROS） in cells was observed. TargetScan software was used to predict and dual-luciferase reporter genes were used to verify the targeting relationship between miR-29a and recombinant human TGFB-induced factor homeobox 2 （TGIF2）. ResultsThe expression level of miR-29a increased with the increase in the concentration of MPP+ （F=590.067，P<0.05）， while cell viability decreased with the increase in the concentration of MPP+ （F=153.561，P<0.05）. Downregulation of miR-29a expression inhibited the apoptosis of PC12 cells （F=301.044，P<0.05） and reduced the level of ROS （F=254.120，P<0.05）. TGIF2 was a downstream target gene of miR-29a. ConclusionmiR-29a may inhibit MPP+-induced oxidative stress and apoptosis of PC12 cells by regulating TGIF2.

[KEY WORDS]Parkinson disease; microRNAs; PC12 cells; apoptosis; TGFB-induced factor 2

帕金森?。≒D）是一種多發(fā)于中老年的慢性神經(jīng)退行性疾病[1]。研究表明，PD的病理進(jìn)展與細(xì)胞氧化應(yīng)激[2]、凋亡率增加[3]、線粒體功能障礙[4]等緊密相關(guān)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度為18～25 nt的短鏈小RNA，目前已被證實(shí)在人類多種疾病包括PD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5-7]。研究表明，miR-29a在PD病人血漿中表達(dá)量明顯減少[8-10]，表明miR-29a可能參與PD的發(fā)生發(fā)展和惡化過(guò)程。然而，miR-29a在PD中的作用及其具體的作用機(jī)制尚不明確。因此，本文通過(guò)1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型，觀察miR-29a對(duì)細(xì)胞中活性氧（ROS）以及凋亡率的影響，為闡明PD發(fā)病的病理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

PC12細(xì)胞由北納生物公司提供，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MPP+、2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）和噻唑藍(lán)比色法（MTT）試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Trizol試劑、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR（qPCR）試劑盒、熒光素酶試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司;對(duì)照質(zhì)粒、anti-miR-29a質(zhì)粒（5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′）均購(gòu)自廣州銳博生物科技公司。7500熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本OLYMBUS公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法以及模型構(gòu)建將PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件設(shè)為體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)加入胰蛋白酶按1∶3傳代。取對(duì)數(shù)期的PC12細(xì)胞以5×105個(gè)接種到6孔板中，過(guò)夜分別培養(yǎng)，加入終濃度為0、100、300、500 μmol/L的MPP+，放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2qPCR實(shí)驗(yàn)收集PC12細(xì)胞，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，合成cDNA。以cDNA為模板，由上海生工生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)、合成miR-29a和U6引物（見(jiàn)表1），進(jìn)行qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。以U6作為參照。反應(yīng)條件：95 ℃、8 min;95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-29a 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)分別向不同濃度MPP+溶液孵育24 h后的PC12細(xì)胞中添加100 μL MTT溶液（500 mg/L），37 ℃孵育4 h，除去MTT溶液，再加入150 μL二甲基亞砜，反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度值（A），計(jì)算各組PC12細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A-空白組A）/（對(duì)照組A-空白組A）×100%。

1.2.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染選取對(duì)數(shù)期PC12細(xì)胞，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)分為4組：0 μmol/L MPP++anti-NC組（A組）、0 μmol/L MPP++anti-miR-29a組（B組）、500 μmol/L MPP++anti-NC組（C組）、500 μmol/L MPP++anti-miR-29a組（D組）。A組、B組PC12細(xì)胞中加入0 μmol/L的 MPP+孵育24 h，并在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和anti-miR-29a質(zhì)粒。C組、D組PC12細(xì)胞中分別加入500 μmol/L 的MPP+孵育24 h后，再分別轉(zhuǎn)染入對(duì)照質(zhì)粒和anti-miR-29a質(zhì)粒。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5細(xì)胞ROS的檢測(cè)收集各組PC12細(xì)胞接種至24孔板中，每孔加入10 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃孵育30 min。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野分析平均綠色熒光強(qiáng)度。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，用PBS沖洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L。根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，在室溫下每孔分別加入膜聯(lián)蛋白 V-FITC和碘化丙啶各5 μL，混合均勻，孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）軟件預(yù)測(cè)miR-29a與重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)因子同源框2（TGIF2）基因的靶向關(guān)系，熒光素酶進(jìn)一步驗(yàn)證。野生型（TGIF2-wt）熒光素酶報(bào)告載體（含有與miR-29a結(jié)合位點(diǎn)）以及突變位型（TGIF2-mut）熒光素酶報(bào)告載體均購(gòu)買自廣州銳博生物科技公司。將TGIF2-wt和TGIF2-mut分別與對(duì)照質(zhì)粒以及anti-miR-29a質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)48 h，采用熒光素酶試劑盒測(cè)定PC12細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度MPP+對(duì)PC12細(xì)胞miR-29a表達(dá)量及細(xì)胞活力的影響與0 μmol/L相比較，100、300、500 μmol/L 的MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)量顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=590.067，P<0.05），PC12細(xì)胞存活率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=153.561，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2轉(zhuǎn)染anti-miR-29a質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞miR-29a表達(dá)量的影響

與A組相比，B組細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)量明顯降低，C組、D組細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=574.765，q=8.106～45.723， P<0.05）;與C組相比，D組PC12細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=40.457，P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3下調(diào)miR-29a對(duì)細(xì)胞ROS、凋亡的影響

與A組相比較，B組PC12細(xì)胞中ROS水平、細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異， C組、D組PC12細(xì)胞中ROS水平、凋亡率明顯增加（F=254.120、301.044，q=7.076～36.233，P<0.05）;與C組相比較，D組ROS的水平、凋亡率顯著降低，差異均具有顯著性（q=13.629、26.247， P<0.05）。見(jiàn)圖1和表3。

2.4miR-29a靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

TGIF2基因3′端非翻譯區(qū)域與miR-29a靶向結(jié)合;與anti-NC與TGIF2-wt共轉(zhuǎn)染相比，anti-miR-29a與TGIF2-wt共轉(zhuǎn)染提高PC12細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性（t=21.266，P<0.05）;但anti-miR-29a與TGIF2-mut共轉(zhuǎn)染對(duì)PC12細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖2和表4。

3討論

PD是一種運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，隨著年齡的增加患病風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重影響老年人的身體健康。研究表明，細(xì)胞凋亡在PD發(fā)生、惡化過(guò)程中具有重要作用[11-12]。研究證實(shí)，miRNA參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，影響神經(jīng)細(xì)胞的分化、凋亡等，從而影響病人的病理進(jìn)程[13]。miRNA在PD病人中的表達(dá)量顯著異常，表明miRNA可能在PD的病理演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[14-16]。研究表明，miR-29a表達(dá)量異常在人類多種疾病中發(fā)揮重要作用，如結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等[17-20]。邱峰等[21]通過(guò)μParaflo微流體芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-29a在PD病人表達(dá)量明顯上調(diào)。韓凱等[5]的研究也進(jìn)一步證實(shí)，miR-29a在PD病人外周血清中表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，可作為PD臨床診斷的潛在新血清標(biāo)志物。但miR-29a在PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用尚不清楚。

目前，采用MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的研究模型[22-23]。本文研究結(jié)果顯示，miR-29a表達(dá)量隨著MPP+濃度的增加逐漸升高，表明miR-29a可能參與PD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。MPP+濃度越高，miR-29a的表達(dá)量越高，其中濃度為500 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的存活率為（45.674±3.152）%，因此選擇500 μmol/L的MPP+作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染anti-miR-29a質(zhì)?？擅黠@降低PC12細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)量，表明轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本文進(jìn)一步研究顯示，抑制miR-29a的表達(dá)量可降低PC12細(xì)胞中ROS水平以及凋亡率，表明抑制miR-29a表達(dá)可能通過(guò)影響細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平和凋亡率，從而參與PD的病理進(jìn)展。

miRNA主要通過(guò)靶向阻礙下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而抑制或誘導(dǎo)疾病的病理進(jìn)程[24]。TGIF2蛋白是三胺酸環(huán)延伸（TALE）蛋白家族成員之一，參與多種腫瘤如膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胃癌等的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡具有重要的調(diào)控作用[25-28]。TGIF2對(duì)膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞同樣具有調(diào)控作用[29-33]。此外，TGIF2能夠參與神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中扮演重要角色。因此，推測(cè)TGIF2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12的凋亡可能存在一定的調(diào)控作用[34-36]。在本實(shí)驗(yàn)中，在線預(yù)測(cè)顯示miR-29a與TGIF2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，表明TGIF2可能是miR-29a的下游靶基因。雙熒光素酶進(jìn)一步驗(yàn)證表明，下調(diào)miR-29a與野生型TGIF2熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染可顯著增加PC12細(xì)胞的熒光素酶活性，而與突變型TGIF2熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染對(duì)PC12細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著影響，證實(shí)TGIF2是miR-29a的下游靶基因，表明miR-29a可能通過(guò)靶向TGIF2抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而阻礙PD的進(jìn)一步惡化。

綜上所述，miR-29a在MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中表達(dá)量增加，且具有一定的濃度依賴性;下調(diào)miR-29a可能通過(guò)靶向TGIF2抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，阻礙其氧化應(yīng)激反應(yīng)，這為PD基因靶向治療提供新的方向。但本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平進(jìn)行了相關(guān)研究，且本實(shí)驗(yàn)未涉及干擾TGIF2進(jìn)行驗(yàn)證，本研究尚顯不足，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充。此外未來(lái)會(huì)進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型等深入探究miR-29a在PD發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。

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