小白菊內(nèi)酯對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制

徐偉華　葛科立　郭云良　綦萍萍　孫銳　周永紅

[摘要]目的探討小白菊內(nèi)酯（PN）對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抗腫瘤作用及其機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞分成兩組，DMSO組以換液形式加入含1/1 000 DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基，PN處理組分別加入PN濃度為15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、27.5 μmol/L的DMEM高糖培養(yǎng)基，應(yīng)用WST-8法檢測(cè)PN處理24、48、72 h對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，隨機(jī)分為DMSO組與PN（25.0 μmol/L）處理組（6、12、24 h），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PN對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、線粒體膜電位、凋亡細(xì)胞比例的影響，Western blot法檢測(cè)PN對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3、Caspase-9、FLIPL、FLIPS、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62）的影響，DCFH-DA探針流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧（ROS）水平，比色法檢測(cè)PN對(duì)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）生成的影響，以及聯(lián)合使用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）1 mmol/L處理細(xì)胞24 h對(duì)上述指標(biāo)的影響。結(jié)果與DMSO組相比，隨著PN作用濃度以及時(shí)間的增加，細(xì)胞活力明顯降低（F濃度=1 778.0，F(xiàn)時(shí)間=439.4，F(xiàn)交互=44.3，P<0.01）。PN作用細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平明顯升高（t=31.58，P<0.01）。PN組隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，線粒體膜電位顯著下降（F=971.1，P<0.01），凋亡細(xì)胞比例升高（F=211.3，P<0.01），Caspase-3、Caspase-9活化增加（F=430.9、866.0，P<0.01），F(xiàn)LIPL和FLIPS表達(dá)下降（F=57.8、83.3，P<0.01），LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)上調(diào)（F=2 219.0、527.7，P<0.01），P62蛋白表達(dá)下調(diào)（F=1 533.0，P<0.01），而HepG2細(xì)胞中ROS水平明顯升高（t=18.06，P<0.01）、GSH水平明顯降低（F=263.4，P<0.01）。聯(lián)合應(yīng)用NAC處理24 h后，PN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加、ROS水平升高和GSH水平降低均明顯減弱，與DMSO組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。結(jié)論P(yáng)N可能通過(guò)減少HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬。

[關(guān)鍵詞]小白菊內(nèi)酯;癌，肝細(xì)胞;活性氧;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)]R285.5[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2021）01-0025-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect and mechanism of parthenolide （PN） on human hepatoma HepG2 cells. MethodsHepG2 cells in the logarithmic growth phase were divided into DMSO group （treated with DMEM high-glucose medium containing 1/1 000 DMSO） and PN group （treated with DMEM high-glucose medium containing PN at doses of 15.0， 17.5， 20.0， 22.5， 25.0， and 27.5 μmol/L）， and WST-8 assay was used to observe the effect of PN on the viability of HepG2 cells after 24， 48， and 72 h of treatment. HepG2 cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into DMSO group and PN treatment group （treated with PN at a dose of 25.0 μmol/L for 6， 12， and 24 h）; flow cytometry was used to evaluate the effect of PN on Ca2+ level， mitochondrial membrane potential， and proportion of apoptotic cells; Western blot was used to observe the effect of PN on levels of cell death-related proteins （Caspase-3， Caspase-9， FLIPL， FLIPS， LC3-Ⅱ， Beclin-1， and P62）; DCFH-DA probe flow cytometry was used to measure the level of reactive oxygen species （ROS）; colorimetry was used to assess the effect of PN on the production of glutathione （GSH） in cells and the effect of co-treatment with PN and N-acetyl-L-cysteine （NAC，1 mmol/L） for 24 h on the above indices. ResultsCompared with the DMSO group， the PN treatment group had a significant reduction in cell viability with the increases in the concentration and duration of PN treatment （Fconcentration=1 778.0，F(xiàn)time=439.4，F(xiàn)interaction=44.3，P<0.01）. After PN treatment for 24 h， there was a significant increase in Ca2+ level in cells （t=31.58，P<0.01）; with the increase in the duration of PN treatment， the PN treatment group had a significant reduction in mitochondrial membrane potential （F=971.1，P<0.01） and a significant increase in the proportion of apoptotic cells （F=211.3，P<0.01）; Caspase-3 and Caspase-9 were activated （F=430.9，866.0;P<0.01）; there were significant reductions in the expression of FLIPL and FLIPS （F=57.8，83.3;P<0.01）， significant increases in the protein expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 （F=2 219.0，527.7，P<0.01）， a significant reduction in the protein expression of P62 （F=1 533.0，P<0.01）， a significant increase in ROS level in HepG2 cells （t=18.06，P<0.01）， and a significant reduction in the level of GSH level （F=263.4，P<0.01）. Co-treatment with NAC for 24 h significantly attenuated cell death， increased ROS level， and reduced GSH level induced by PN， with no significant difference from the DMSO group （P>0.05）. ConclusionPN may induce cell apoptosis and autophagy by reducing the production of GSH and increasing the level of ROS in HepG2 cells.

[KEY WORDS]parthenolide; carcinoma， hepatocellular; reactive oxygen species; apoptosis

肝癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率逐年升高，并且病人呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。肝癌治愈率低、死亡率高，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1]。小白菊內(nèi)酯（PN）是從小白菊中提取的一種倍半萜烯內(nèi)酯類天然產(chǎn)物，歐美地區(qū)人們將其作為一種解熱鎮(zhèn)痛藥使用[2]，研究證實(shí)其具有抗腫瘤活性[3]。已有研究顯示，PN具有抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與特異性抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和誘導(dǎo)DNA烷基化有關(guān)[4-5]。但PN對(duì)肝癌細(xì)胞作用及其機(jī)制尚不清楚?；钚匝酰≧OS）在人類各種疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。低水平ROS通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境平衡發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，而高水平ROS在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ROS也參與癌細(xì)胞凋亡[6-7]。本文研究旨在探討PN是否通過(guò)影響ROS水平對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人源肝癌細(xì)胞株HepG2（購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)），加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（BI）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone），置于37.0 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PN購(gòu)于MCE公司（美國(guó)），以DMSO為溶劑配制成200 mmol/L儲(chǔ)存液，分裝后并凍存于-80 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)用一抗p62、caspase-3、caspase-9、FLIP、PARP1、LC3-Ⅱ和Beclin-1均購(gòu)自于Cell Signaling Technology公司，β-actin購(gòu)自于AB Clonal公司。

1.2WST-8細(xì)胞毒力實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1∶3比例接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，加入DMEM高糖培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至75%時(shí)，隨機(jī)分為兩組。DMSO組加入含1/1 000 DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基，PN處理組分別加入PN濃度為15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、27.5 μmol/L的DMEM高糖培養(yǎng)基。各組細(xì)胞分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔以換液形式加入含10 μL CCK-8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL（另設(shè)一個(gè)空白孔以去除背景值），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育50 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（A）。計(jì)算細(xì)胞抑制率，繪制細(xì)胞毒力圖，計(jì)算PN作用于HepG2的IC50值，取適宜濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1細(xì)胞分組及處理HepG2細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化重懸后均勻地接種于6 cm平皿（每皿1.5×106個(gè)細(xì)胞），隨機(jī)分為DMSO組與PN組，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、融合度為75%左右時(shí)，DMSO組細(xì)胞不作處理，PN組細(xì)胞加入含25 μmol/L PN的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱分別孵育6、12、24 h。

1.3.2細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平檢測(cè)各組細(xì)胞處理后，使用Fluo-3AM鈣離子探針試劑盒（S1056，碧云天，上海）和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。

1.3.3線粒體膜電位檢測(cè)用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞約1 min，收集細(xì)胞，使用JC-1線粒體膜電位試劑盒（碧云天，上海）檢測(cè)線粒體膜電位，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)各組細(xì)胞處理后，使用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（40305ES60，上海翊圣生物）、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平各組細(xì)胞處理后，用RIPA裂解液（P0013C，碧云天，上海）裂解細(xì)胞，采用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和抗體孵育，最后將膜置于ECL化學(xué)發(fā)光顯影液中，充分反應(yīng)后置于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行曝光顯影。觀察Caspase-3、Caspase-9、FLIPL、FLIPS、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62和Beclin-1蛋白表達(dá)條帶，并使用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3.6ROS水平檢測(cè)各組細(xì)胞處理之后，使用DCFH-DA探針試劑盒（S0033，碧云天，上海）和流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。

1.3.7谷胱甘肽（GSH）水平檢測(cè)各組細(xì)胞處理后，使用GSH檢測(cè)試劑盒（S0053，碧云天，上海）和

1期徐偉華，等. 小白菊內(nèi)酯對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制27

流式細(xì)胞儀檢測(cè)GSH水平。

以上所有實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度PN對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

WST-8細(xì)胞毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PN濃度及處理時(shí)間的增加，HepG2的細(xì)胞活力逐漸下降（F濃度=1 778.0，F(xiàn)時(shí)間=439.4，F(xiàn)交互=44.3，P<0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2PN對(duì)HepG2細(xì)胞Ca2+以及線粒體膜電位水平影響

與DMSO組Ca2+濃度（3.83±0.35）相比，PN處理24 h HepG2細(xì)胞中Ca2+濃度（49.33±1.40）明顯升高，差異有顯著性（t=31.584，P<0.01）。JC-1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，隨著PN處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞線粒體膜電位逐漸下降，在PN處理24 h后，HepG2細(xì)胞線粒體膜電位幾乎完全喪失，差異有顯著性（F=971.1，P<0.01）。見(jiàn)圖2A。

2.3PN對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)影響

DMSO組和PN處理6、12、24 h組HepG2細(xì)胞總凋亡比例比較差異有顯著性（F=211.3，P<0.01）。見(jiàn)圖2B。PN處理后，HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Caspase-3明顯被活化（F=430.9、866.0，P<0.01），而兩個(gè)外源性凋亡相關(guān)的蛋白FLIPL（長(zhǎng)型）和FLIPs（短型）表達(dá)均下降（F=57.8、83.3，P<0.01）。見(jiàn)圖3、表1。

2.4PN對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響

PN處理后，HepG2細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)均升高，P62蛋白表達(dá)下降，差異有顯著性（F=527.7～2 219.0，P<0.01）。見(jiàn)圖4、表1。

2.5PN及其聯(lián)合應(yīng)用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響

與DMSO組（2.43±0.33）相比，PN處理24 h后，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平（29.33±1.45）明顯升高，差異有顯著性（t=18.06，P<0.01）。PN聯(lián)合應(yīng)用NAC后細(xì)胞內(nèi)ROS水平（5.63±0.59）較PN組明顯下降，NAC組（2.17±0.09）與DMSO組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。聯(lián)合應(yīng)用NAC后，PN誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力下降消失，且聯(lián)合應(yīng)用NAC后PN對(duì)凋亡蛋白PARP-1、Caspase-9和Caspase-3的活化作用消失。PN處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平（12 h為8.64±0.28，24 h為4.41±0.26）較DMSO組（13.13±0.27）明顯下降，而聯(lián)合NAC作用24 h后HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平（12.80±0.43）較PN組（4.22±0.17）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=263.4，P<0.01）。見(jiàn)圖5。

3討論

PN是從小白菊中提取的天然倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有優(yōu)異的抗癌活性，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用[8]。本文研究結(jié)果顯示，PN對(duì)HepG2細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，且呈濃度與時(shí)間依賴性。細(xì)胞線粒體膜電位的下降是線粒體依賴性凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PN處理HepG2細(xì)胞后Ca2+內(nèi)流增加、線粒體膜電位下降，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加并超載，線粒體通透性增加，細(xì)胞色素C釋放，從而啟動(dòng)相關(guān)的凋亡信號(hào)[10]。說(shuō)明PN在HepG2細(xì)胞中可誘導(dǎo)線粒體外膜通透（MOMP）。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，屬于細(xì)胞的自然死亡。而正常細(xì)胞增殖、分化失控，不能正常發(fā)生凋亡，則會(huì)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。既往研究結(jié)果表明，PN可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PN處理可使HepG2細(xì)胞總凋亡比例明顯增高，隨著PN處理時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞比例升高。內(nèi)源性凋亡是一種由多種微環(huán)境改變引起的包括（但不限于）生長(zhǎng)因子耗竭、DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、ROS超載、復(fù)制應(yīng)激、微管改變或有絲分裂缺陷等引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡（RCD），其啟動(dòng)階段會(huì)出現(xiàn)MOMP[12]，由Caspase執(zhí)行蛋白（主要是Caspase-3）來(lái)執(zhí)行[13]。本文結(jié)果顯示，PN作用后HepG2細(xì)胞內(nèi)源性凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase-9、凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3活化，PARP1剪切型蛋白活化，提示PN可能在HepG2細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡;隨著PN作用時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)外源性凋亡相關(guān)的蛋白FLIPL（長(zhǎng)型）和FLIPs（短型）表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，提示PN可能通過(guò)下調(diào)FLIP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生外源性凋亡。

有研究結(jié)果表明，PN可在多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[14]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞程序性死亡的另外一種方式。LC3是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物，LC3蛋白在自噬過(guò)程中形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體膜上[15]。Beclin-1是自噬體形成過(guò)程中所必需的自噬相關(guān)蛋白質(zhì)，其除了促進(jìn)自噬體的形成，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡的分子開關(guān)蛋白[16]。P62蛋白是自噬激活的標(biāo)記物，可通過(guò)與LC3的相互作用定位于自體吞噬體，不斷被自噬-溶酶體系統(tǒng)降解。因此，可溶性P62蛋白減少，同時(shí)LC3-Ⅱ增加則表明自噬流活化[17]。本文研究結(jié)果顯示，PN處理后HepG2細(xì)胞可溶性P62蛋白水平明顯下降，Beclin-1蛋白水平明顯升高，LC3-Ⅱ明顯增加，說(shuō)明自噬可能參與了PN誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高后，氧化還原平衡狀態(tài)被打破引起的氧化應(yīng)激（OS）不僅可抑制線粒體中ATP合成，還會(huì)對(duì)細(xì)胞器和細(xì)胞膜造成損傷[18]。本文研究結(jié)果顯示，PN誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中產(chǎn)生了大量的ROS，且呈時(shí)間依賴性增加，而NAC可以完全阻斷PN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及ROS水平的升高，提示ROS的積累導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，激活一系列死亡信號(hào)通路，導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，PN處理后HepG2細(xì)胞中GSH明顯減少，說(shuō)明PN可能通過(guò)下調(diào)GSH水平，從而誘導(dǎo)ROS水平升高，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PN可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和自噬，該作用可能與PN通過(guò)抑制GSH誘導(dǎo)ROS水平升高密切相關(guān)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）