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    UPLC-MS/MS法測(cè)定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及代謝物

    2021-05-08 08:42:10尹青春譚高好鄧浩潘永波張容鵠徐彬
    食品工業(yè) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:咪唑類硝基甲酸

    尹青春 ,譚高好,鄧浩,潘永波,張容鵠,徐彬

    1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所,海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(???570100);2.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心(???570100)

    硝基咪唑類藥物是一類具有5-硝基咪唑環(huán)共同結(jié)構(gòu)的合成抗菌類藥物,常見(jiàn)的有甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、羥甲基甲硝咪唑等。硝基咪唑類衍生物易與生物體內(nèi)的許多大分子如酶、DNA和受體等發(fā)生超分子結(jié)合[1],在抗癌[2-3]、祛痘[4]、抗厭氧菌[5]、抗寄生蟲[6]等方面有廣泛醫(yī)學(xué)用途。此外,使用此類藥物對(duì)動(dòng)物體重還具有增加作用[7],因此在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛違法使用。有研究表明,硝基咪唑類藥物和其代謝物具有致突變和致癌性[8],禽類肉和蛋制品中的硝基咪唑類藥物殘留對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成直接威脅。

    我國(guó)和歐盟已將硝基咪唑類藥物列為動(dòng)物性食品不得檢出的對(duì)象。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[9]及《農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)》[10]明確規(guī)定地美硝唑、甲硝唑允許作治療用,但不得在動(dòng)物性食品的所有可食組織中檢出。歐盟理事會(huì)也將硝基咪唑類藥物列入A類禁用藥物,不得在任何食品中檢出[11]。但違法使用硝基咪唑類藥物現(xiàn)象屢禁不止,雞蛋等農(nóng)產(chǎn)品抽檢不合格仍時(shí)有發(fā)生。

    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法具有快速、高效、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn),是目前檢測(cè)硝基咪唑類藥物殘留的常用方法。李小橋等[12]使用UPLC-MS/MS法測(cè)定牛肉中4種硝基咪唑類藥物殘留量。雞蛋樣品中多種硝基咪唑類藥物及其代謝物的UPLC-MS/MS批量檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。此次試驗(yàn)從提取溶劑、凈化方式、復(fù)溶液、液相流動(dòng)相、色譜柱、質(zhì)譜條件等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立UPLC-MS/MS方法,同時(shí)測(cè)定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物,為政府監(jiān)管部門提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    Thermo TSQ Quantiva三重四極桿質(zhì)譜儀[配有電噴霧離子(ESI)源]、Ultimate 3000超高效液相色譜儀,美國(guó)Thermo公司;Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);多管渦旋混合器(德國(guó)Heidolph公司);Mettler XS204型十萬(wàn)分之一分析天平(美國(guó)Mettler Toledo公司);SCIENTZ-950E超聲波提取器(寧波新芝生物科技公司)。

    16種硝基咪唑混標(biāo)(100 μg/mL,A ChmTek.Inc.),其它均為色譜純。雞蛋購(gòu)于??谑行阌^(qū)秀英街道向榮村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取適量羥甲基甲硝咪唑、羅硝唑D3標(biāo)準(zhǔn)品,配制成質(zhì)量濃度為100和1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液;17種混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(1.0 μg/mL):準(zhǔn)確吸取100 μg/mL 16種硝基咪唑混標(biāo)和100 μg/mL的羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)使用溶液各100 μL,用甲醇定容至10 mL。所有標(biāo)準(zhǔn)使用溶液置于-18 ℃冰箱冷藏保存。

    1.2.2 樣品前處理

    將雞蛋樣品混合均勻并準(zhǔn)確稱取2.0 g,加入100 μL質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的羅硝唑D3的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,再加入10 mL 1%甲酸乙腈,漩渦10 min,超聲10 min,以10 000 r/min離心5 min;凈化:取2.0 mL上清液,加入200 mg C18,漩渦10 min,以10 000 r/min離心5 min,取1.0 mL上清液,于40 ℃氮吹干,加入1.0 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶,過(guò)0.22 μm有機(jī)相膜,上機(jī)測(cè)定。

    1.3 儀器條件

    色譜柱,ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);流動(dòng)相A,0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B,甲醇溶液;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5.0 μL,流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0~0.25 min,5% B;0.25~3 min,5% B~65% B;3~4 min,65% B~99% B;4~5 min,99% B;5~5.01 min,99% B~5% B;5.01~7 min,5% B。

    質(zhì)譜:離子源ESI源,正離子模式;掃描模式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式;噴霧電壓3.5 kV;汽化溫度350 ℃;離子傳輸溫度 350 ℃;鞘氣(氮?dú)猓毫?2 Arb;輔助氣(氮?dú)猓毫? Arb;碰撞氣:高純氬氣,壓力為1.5 mTorr。優(yōu)化后17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

    表1 17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 色譜柱的篩選

    試驗(yàn)對(duì)比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、Thermo Accucore C18(2.6 μm,2.1×100 mm)和ACE Ultra Core 2.5 Super C18(2.5 μm,2.1 mm×100 mm)3種色譜柱對(duì)17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果。圖1為Waters BEH C18色譜柱的目標(biāo)化合物總離子色譜圖,其分離效果最好。劉燕等[13]在研究超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-Exactive Orbitrap)快速檢測(cè)飼料中16種硝基咪唑類藥物時(shí)也發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18色譜柱對(duì)16種硝基咪唑類藥物的檢測(cè)靈敏度及色譜峰型較好。因此選擇Waters BEH C18進(jìn)行方法研究。

    圖1 目標(biāo)化合物總離子色譜圖(BEH柱)

    2.2 流動(dòng)相的篩選

    試驗(yàn)對(duì)比了0.1%甲酸水/甲醇、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)/乙腈4種不同流動(dòng)相體系對(duì)17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離及響應(yīng)效果。結(jié)果表明:體系含有甲醇的流動(dòng)相對(duì)大部分硝基咪唑類藥物及其代謝物的分離效果均較好,其中0.1%甲酸水/甲醇的色譜峰型、信號(hào)響應(yīng)、穩(wěn)定性最優(yōu)。周興鑫[14]在建立生鮮乳中250種獸殘高通量快速篩查平臺(tái)時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入0.1%的甲酸對(duì)于各化合物響應(yīng)強(qiáng)度具有明顯的提高。因此選擇0.1%甲酸水/甲醇作為體系的流動(dòng)相。

    2.3 樣品提取液的篩選

    分別以甲醇、乙腈、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈等11種有機(jī)溶劑作為提取液,對(duì)比17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的提取效果。結(jié)果表明:使用1%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取時(shí),回收率為70%~130%,且1%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取效果無(wú)明顯差異,考慮到綠色環(huán)保,選擇1%甲酸乙腈作為提取液。

    2.4 凈化方式的篩選

    已有文獻(xiàn)報(bào)道采用Waters PRIME HLB、MCX[15]、PCX[16]、RETAIN-CX等作為凈化樣品的固相萃取柱,還有采用PSA[17-18]、MgSO4、C18或者幾種混合作為凈化樣品的吸附劑?;谝陨衔墨I(xiàn)報(bào)道,試驗(yàn)比較了MCX、HLB、PSA、C184種凈化方式的凈化效果,以加標(biāo)量為50 μg/kg的回收率為指標(biāo),凈化效果最好的是Agela Cleanret S C18,目標(biāo)物回收率達(dá)90%~110%,其他3種凈化方式回收率浮動(dòng)較大。因此,采用200 mg Agela Cleanret S C18吸附劑進(jìn)行樣品凈化。

    2.5 復(fù)溶液的選擇

    取1 mL凈化后的提取液,經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s后,對(duì)比不同比例的乙腈和甲醇作為復(fù)溶液對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示:使用1%乙腈水、5%乙腈水作為復(fù)溶液時(shí),大部分目標(biāo)物的峰型較差;使用10%甲醇水作為復(fù)溶液時(shí),小部分目標(biāo)物的峰型不好;使用50%和80%甲醇水溶液時(shí),各目標(biāo)物峰型較好,且均可獲得較為滿意的回收率。考慮到成本,選擇50%甲醇水溶液為復(fù)溶液。

    2.6 線性范圍、檢出限、定量限、精密度

    采用優(yōu)化好的UPLC-MS/MS參數(shù)進(jìn)行方法學(xué)研究,結(jié)果如表2所示。17種硝基咪唑類藥物及其代謝物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍為1.0~100 ng/mL,相關(guān)系數(shù)r≥0.999 0,羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、噻苯噠唑、奧硝唑、阿苯噠唑亞砜、異丙硝唑、奧芬達(dá)唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、氟苯咪唑和芬苯達(dá)唑的檢出限分別為0.056,0.115,0.065,0.046,0.026,0.088,0.115,0.032,0.016,0.083,0.010,0.016,0.004,0.006,0.005,0.010和0.003 μg/kg,定量限均為5.0 μg/kg;SN/T 2624—2010[19]規(guī)定硝基咪唑類測(cè)定低限為1.0 μg/kg;SN/T 1626—2019[20]規(guī)定羥甲基甲硝咪唑測(cè)定低限為1.0 μg/kg,甲硝唑、洛硝噠唑、地美硝唑、替硝唑、奧硝唑測(cè)定低限均為0.5 μg/kg。方法的檢出限均低于標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)低限,說(shuō)明該檢測(cè)方法靈敏度較高。對(duì)質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL的17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定,該方法的δRSD(n=6)為0.4%~2.3%,說(shuō)明儀器具有良好的精密度。

    表2 17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的線性關(guān)系、檢出限、定量限

    接表2

    2.7 回收率試驗(yàn)

    將17種目標(biāo)化合物添加到空白雞蛋樣品進(jìn)行50,100和250 μg/kg 3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn),每個(gè)水平取6個(gè)平行樣,平均回收率為73.1%~117.7%,方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差δRSD為0.6%~6.5%,說(shuō)明該方法回收率及重復(fù)性較好。

    2.8 樣品測(cè)定

    采用試驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS方法對(duì)海南省18個(gè)市縣菜市場(chǎng)抽檢的雞蛋樣品共78批次中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的殘留量進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定2次,結(jié)果均未檢出此類獸藥。雖然,目前在抽檢的雞蛋中均未檢出17種硝基咪唑類藥物及其代謝物,但仍需加強(qiáng)此類獸藥殘留檢測(cè)的監(jiān)控。

    3 結(jié)論

    通過(guò)優(yōu)化分離條件和樣品提取凈化條件,建立了UPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的方法。樣品經(jīng)1%甲酸乙腈提取,經(jīng)C18吸附劑凈化,以ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)色譜柱分離,0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相梯度洗脫,電噴霧正離子模式(ESI+),多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描,洛硝噠唑內(nèi)標(biāo)法定量,其他16種硝基咪唑類藥物及其代謝物外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示,17種目標(biāo)化合物在1.0~100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r≥0.999 0,在3個(gè)不同濃度添加水平下,平均加標(biāo)回收率為73.1%~117.7%,方法δRSD為0.6%~6.5%,檢出限為0.003~0.115 μg/kg,定量限為5.0 μg/kg。該方法前處理簡(jiǎn)單,具有凈化效果好、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)。測(cè)定海南省18個(gè)市縣抽檢的雞蛋樣品(共78批次),結(jié)果均未檢出此類獸藥。該方法適用于大批量雞蛋中17種硝基咪唑類藥物及其代謝物的快速篩查、確證及定量。

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