響應(yīng)面法優(yōu)化蟹味菇酶解工藝

江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院（淮安 223003）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreusBigelow），又名真姬菇，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是北溫帶一種優(yōu)良的食用菌[1]。蟹味菇含有豐富維生素和17種氨基酸，其中賴氨酸、精氨酸的含量高于一般菇類，有助于青少年益智增高，還可抗癌、降低膽固醇[2-3]。蟹味菇子實體的提取物具有真菌多糖、嘌呤、腺苷等多種生理活性成分，能增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、促進(jìn)抗體形成等[4-5]。影響蟹味菇酶解的主要因素有酶用量、pH、溫度和時間[6]。通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計，研究確定蟹味菇酶解工藝條件，為蟹味菇的后期加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟹味菇（產(chǎn)地淮安）；風(fēng)味蛋白酶（鄭州百思特食品添加劑有限公司）；纖維素酶（寧夏和氏璧生物工程有限公司）；氫氧化鈉（安徽蕪湖化學(xué)試劑廠）。

800Y粉碎機(jī)（武義海納電器有限公司）；MS304電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)）；PHS-3E精密酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；TD5G離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟹味菇預(yù)處理蟹味菇經(jīng)清洗、瀝干后，置于60 ℃條件真空干燥至恒重，然后粉碎成粒徑約0.17 mm粉狀，待用。

1.2.2 蟹味菇酶解液反應(yīng)

稱取一定量的蟹味菇粉，按照固液比1∶8（g/mL）制成待測液，加入一定量的風(fēng)味蛋白酶（以底物百分比），調(diào)節(jié)pH，在設(shè)定溫度下進(jìn)行水解處理[7]。水解結(jié)束后迅速加熱至90 ℃維持10 min滅酶活，冷卻后再經(jīng)4 000 r/min離心15 min，取上清液即得酶解液。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 酶用量對酶解反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，分別添加相對于底物的0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至7.0，在40 ℃下反應(yīng)5 h，水解結(jié)束后于90 ℃加熱10 min滅酶活，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.3.2 pH對酶解反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，加入相對于底物的2.0%風(fēng)味蛋白酶，分別調(diào)節(jié)pH至5，6，7，8和9，在40 ℃下反應(yīng)5 h，水解結(jié)束后于90 ℃加熱10 min滅酶，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.3.3 反應(yīng)溫度對酶解反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，加入相對于底物的2.0%風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至6.0，分別在30，40，50，60和70 ℃下反應(yīng)5 h，水解結(jié)束后于90 ℃加熱10 min滅酶，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.3.4 反應(yīng)時間對酶解反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確量取5份一定量的蟹味菇粉待測液，加入相對于底物的2.0%風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至6.0，在60 ℃下反應(yīng)，反應(yīng)時間分別設(shè)定為3，4，5，6和7 h，水解結(jié)束后于90 ℃加熱10 min滅酶，以4 000 r/min離心15 min，取上清液作為酶解液，測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶解反應(yīng)

比較4個單因素試驗結(jié)果，確定酶解溫度、pH和酶解時間3個因素作為酶解反應(yīng)主要影響因素，以單因素試驗中對酶解反應(yīng)各因素條件的最優(yōu)點設(shè)置基準(zhǔn)點，以Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken方法進(jìn)行試驗設(shè)計[8-10]，以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標(biāo)，確定最優(yōu)的酶解條件，響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

1.2.5 酶解效果評價

此次試驗酶解效果評價以酶解液中氨基酸態(tài)氮含量表示，酶解液中氨基酸態(tài)氮含量越高，則說明酶解效果越好。氨基酸態(tài)氮含量的測定方用選用甲醛滴定[11-12]。

稱取5.0 g樣品，用50 mL 80 ℃左右的蒸餾水分幾次洗入100 mL燒杯中，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混勻后過濾。吸取10.0 mL濾液，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動磁力攪拌器，用0.050 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH 8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，計算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH 9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時做試劑空白試驗，氨基酸態(tài)氮含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100 g；V1為測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2為試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為與1.00 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（c=1.000 mol/L）相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；m為稱取試樣的質(zhì)量，g；V3為試樣稀釋液的取用量，mL；V4為試樣稀釋液的定容體積，mL；100為單位換算系數(shù)。

表1 中心組合設(shè)計的因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量對酶解反應(yīng)的影響結(jié)果

由圖1可知，隨風(fēng)味蛋白酶用量的增加，蟹味菇酶解產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量也相應(yīng)增加，當(dāng)酶用量為2.0%時，酶解產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大，即酶解程度達(dá)到最大，若再繼續(xù)增加風(fēng)味蛋白酶用量，酶解產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量則基本維持恒定，變化不大。綜合考慮蛋白酶解條件，選擇2%的風(fēng)味蛋白酶用量為最佳條件。

2.2 pH對酶解反應(yīng)的影響結(jié)果

由圖2可知，pH對蟹味菇酶解有較大影響。當(dāng)pH由5.0至9.0分別進(jìn)行試驗時，隨著pH增大，蟹味菇酶解產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增后降趨勢，其中pH為6.0時，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大。當(dāng)pH為5.0到6.0即弱酸性條件時，酶解程度較大，產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量較高；當(dāng)pH在7.0到9.0即弱堿性條件時，酶解程度較小，產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮含量較低。所以，試驗選擇pH 6.0時作為最佳酶解pH。

圖1 風(fēng)味蛋白酶用量對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

圖2 酶解pH對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

2.3 酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響結(jié)果

由圖3可知，隨著酶解溫度由20 ℃升高至70 ℃，蟹味菇酶解液中氨基酸態(tài)氮含量也相應(yīng)增加，當(dāng)酶解溫度為60 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量基本達(dá)到最大，隨后溫度繼續(xù)升高，氨基酸態(tài)氮含量逐漸減小，可能是溫度過高對酶促化活性產(chǎn)生一定的抑制作用。所以，選擇60 ℃作為酶解溫度最佳條件。

圖3 酶解溫度對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

2.4 反應(yīng)時間對酶解反應(yīng)的影響結(jié)果

由圖4可知，隨著酶解時間的不斷延長，蟹味菇酶解液中氨基酸態(tài)氮含量也相應(yīng)增加，酶解3～5 h，氨基酸態(tài)氮含量不斷增加；酶解5 h以后，隨時間的繼續(xù)延長，氨基酸態(tài)氮含量基本維持較小波動范圍。從酶解徹底性分析，選擇6 h作為最佳酶解處理時間。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解反應(yīng)條件

試驗以蟹味菇酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，安排了17個處理組合，每個處理組合設(shè)3個平行樣，取平均值，分別確定酶解液中氨基酸態(tài)氮含量（Y），試驗結(jié)果及預(yù)測見表2。

圖4 酶解時間對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

將表2結(jié)果代入Design-Expert 8.0進(jìn)行方差分析，得多元回歸方程：Y=5.79-0.15A-0.19B-7.50×10-3C+0.087AB+0.023AC+0.10BC-0.36A2-0.63B2-0.20C2。其中，Y為氨基酸態(tài)氮含量，A為酶解溫度，B為酶解pH，C為酶解時間。對回歸方程進(jìn)行方差析，結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型的p＜0.000 1，檢驗結(jié)果極顯著，回歸模型失擬項p=0.181 8＞0.05，檢驗結(jié)果不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.996 8，說明回歸方程擬合程度很好。校正系數(shù)R2=0.932 7，說明該模型能解釋99.27%響應(yīng)值變化，說明試驗值與預(yù)測值非常接近。對回歸方程進(jìn)行分析，得到最佳酶解條件。

由圖5～圖7可知，當(dāng)一個因素固定不變時，試驗初期隨另一因素增大，氨基酸態(tài)氮含量也相應(yīng)增加，當(dāng)達(dá)到一定程度后反應(yīng)又會受到一定抑制，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量降低。圖6底部的等高線形狀為圓形，圖5和圖7底部的等高線形狀為橢圓形，表明酶解溫度與酶解時間之間交互作用不顯著，而酶解溫度與酶解pH、酶解pH與酶解時間交互作用顯著，該結(jié)果與方差分析結(jié)果保持一致。

表3 回歸模型的方差分析

圖5 酶解溫度和酶解pH交互作用對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

圖6 酶解溫度和酶解時間交互作用對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

圖7 酶解pH和酶解時間交互作用對對蟹味菇酶解結(jié)果的影響

通過對回歸方程進(jìn)行分析，得到模型的極點值，即酶解溫度57.73 ℃、酶解pH 5.82、酶解時間5.92 h，此時氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值（5.824 08 g/100 mL）；考慮到實際操作，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行修正：酶解溫度58 ℃、酶解pH 6.0、酶解時間6 h，并重復(fù)3次進(jìn)行驗證試驗，測得氨基酸態(tài)氮平均含量為5.81 g/100 mL。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.0進(jìn)行方差分析優(yōu)化蟹味菇酶解工藝條件。結(jié)果表明：酶解溫度、酶解pH、酶解溫度與酶解pH交互作用、酶解pH與酶解時間交互作用及各因素二次方對水解產(chǎn)物氨基酸態(tài)氮含量均有顯著影響。

回歸分析和驗證試驗結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化蟹味菇酶解工藝條件切實可行，所得最佳酶解條件為風(fēng)味蛋白酶用量2%、酶解溫度58 ℃、酶解pH 6.0、酶解時間6 h，測得氨基酸態(tài)氮含量為5.81 g/100 mL。此次試驗為蟹味菇的后期加工利用提供理論依據(jù)。