鞘內(nèi)注射ETAR拮抗藥對大鼠骨癌疼痛改善情況及其對ERK通路的影響

何遠山,蘇 宏,伊國恩,張 敏,徐 鵬，李澤清

骨癌痛(bone cancer pain，BCP)主要是由原發(fā)性惡性腫瘤，如乳腺癌、骨癌、肺癌等中晚期繼發(fā)性骨轉(zhuǎn)移引起，常引起劇烈疼痛反應[1]。目前，惡性腫瘤發(fā)病率不斷上升，隨之引起的骨癌痛病例數(shù)不斷增加，嚴重影響人們的生活質(zhì)量[2，3]。BCP發(fā)病機制十分復雜，目前尚未完全闡明，且尚無特異性根治手段，臨床約45%的BCP患者疼痛無法有效控制，因此明確BCP發(fā)病機制有助于制定有效的防治措施。內(nèi)皮素A受體(endothelin A receptor，ETAR)屬于特異性G蛋白偶聯(lián)受體，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞跨膜區(qū)。研究顯示，內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)可通過激活ETAR參與調(diào)控炎癥痛及神經(jīng)病理性疼痛，說明阻斷ETAR可選擇性減少傳入初級傷害感受器，進而減輕疼痛作用[4]。研究認為，BCP與神經(jīng)病理性疼痛機制具有相似之處[5]，但關(guān)于ET-1及其受體在BCP中的變化尚不清楚。為此，本研究通過建立BCP大鼠模型，觀察鞘內(nèi)注射ETAR拮抗藥對BCP大鼠疼痛的影響，并初步探討其調(diào)控機制，為臨床BCP的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠，3周齡5只，體質(zhì)量(60±6) g，7周齡60只體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號【SCXK(京)2019-0009】；飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替、恒溫恒濕環(huán)境下，自由飲水和攝食，動物實驗過程符合減少、替代和優(yōu)化3R原則。

1.1.2 主要試劑和儀器 Walker256乳腺癌肉瘤細胞株，購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所。ETAR受體拮抗藥BQ123(美國Calbiochem公司)，RT-qPCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo公司)，兔抗大鼠ET1、ETAR、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulatory protein kinase，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2)多抗(一抗，美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(美國Santa Cruz公司)，Von Frey電子痛閾測量儀(美國IITC公司)，醫(yī)學X線攝像系統(tǒng)(荷蘭Philips公司)，Image J圖像分析軟件(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1 BCP模型制備 取對數(shù)期生長Walker256細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/ml接種至3周齡大鼠腹腔，1 ml/只，常規(guī)飼養(yǎng)7 d，收集腹水，1000 r/min離心5 min，取沉淀，經(jīng)Hank液洗滌、去除紅細胞，并用生理鹽水調(diào)整細胞密度為1×108/ml備用。參照文獻[6]建立骨癌痛BCP大鼠模型：腹腔注射戊巴比妥那麻醉，左后肢剃毛消毒，切開皮膚，鈍性分離肌肉組織，用牙科探針在脛骨干骺端平臺處打孔，避開髕韌帶，采用微量注射器，注入10 μl Walker256細胞混懸液，拔出針頭后用醫(yī)用膠水封堵針孔，縫合并消毒傷口，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。

1.2.2 鞘內(nèi)置管術(shù) 取60只成年雌性大鼠，腹腔注射戊巴比妥那麻醉，沿L5～6間隙作水平皮膚切口，將無菌導管經(jīng)棘突間隙向頭端置入約2.5 cm，并做皮下隧道，將導管封閉后固定于頸背，縫合傷口，大鼠清醒后，經(jīng)導管注入2%利多卡因10 μl，30 s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢麻痹則判定置管成功，分籠飼養(yǎng)，置管后3 d內(nèi)腹腔注射20萬U青霉素預防感染。

1.2.3 分組及干預 置管成功大鼠，隨機分為假手術(shù)(sham)組、假手術(shù)+生理鹽水(sham+NS)組、BCP組、BCP+ETAR拮抗藥(BCP+BQ123)組。BCP組、BCP+BQ123組建立BCP大鼠模型，sham組、sham+NS同法注射等量生理鹽水。造模第14天，評估機械性縮足反射閾值(pain withdrawal threshold，PWT)較注射CFA前顯著降低提示建模成功，否則剔除。

取建模成功BCP組13只，BCP+BQ123組、sham組、sham+BQ123組各14只，于建模后第14天，BCP+BQ123組、sham+BQ123組分別鞘內(nèi)注射30 μmol的BQ123 7 μl，BCP組、sham組鞘內(nèi)注射7 μl生理鹽水，以小鼠出現(xiàn)甩尾反應為注射成功。

1.2.4 疼痛行為學檢測 鞘內(nèi)注射前即刻，注射后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h分別評估各組大鼠疼痛行為學。參照文獻[7]應用Von Frey痛閾測量儀檢測患肢PWT值：安靜環(huán)境適應20 min左右，刺激針垂直刺激跖部，序貫增加刺激強度，每種強度檢測5次，每兩次間隔30 s，記錄使大鼠產(chǎn)生抬足反射的最小刺激強度作為PWT。參照文獻[8]，將小鼠置于60 cm×30 cm×10 cm透明玻璃箱，記錄2 min內(nèi)大鼠出現(xiàn)自發(fā)抬足次數(shù)(number of spontaneous flinches，NSF)，記錄5次平均值，每次間隔15 min。

1.2.5 脛骨X射線檢查 建模第14天，末次評估大鼠疼痛行為學后，戊巴比妥那腹腔注射麻醉大鼠，固定患肢，采用醫(yī)學X線攝像系統(tǒng)(射線強度50 kV，時間90 s)對大鼠脛骨拍片，分析X線片提示的骨質(zhì)破壞情況。

1.2.6 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2 mRNA表達量檢測 X線片拍攝結(jié)束后處死各組大鼠，取L4～6節(jié)段脊髓，-80 ℃保存。取50 mg脊髓組織，組織剪剪碎后，采用Trizol法提取脊髓組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以之為模板進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)，按照試劑盒說明書設(shè)定反應體系，并按照反應條件：94℃預變性5 min；(94 ℃變性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s)40個循環(huán)擴增。以β-actin為管家基因，2-ΔΔCT為目的基因的相對表達強度。引物序列：ET1: F:5′-ACGCTAGCTGATGCTAGCTAG-3′,R:5′-ATACCATGGCTGATGCTGATC-3′;ETAR:F:5′-CCATGCACTAGCGTAGCA-3′,R:5′-GCTAGTCGATGCTGACCT-3′;ERK1/2:F:5′-TAGCTCGTAGCTGATAGCT-3′,R:5′-CCGATGCTGATGCTGATGC-3′;β-actin:F:5′-CCTAGCTAGCCTAGCTGATGC-3′, R:5′-GCTGATCCTGATGTCGTAGTC-3′。

1.2.7 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達量檢測 取50 mg脊髓組織，加入液氮進行研磨，轉(zhuǎn)至離心管中，加入0.5 ml細胞裂解液，于冰上孵育20 min，12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液，進行BCA蛋白定量；取50 μg待測蛋白，加入等量上樣緩沖液后，沸水浴10 min變性，再次離心后取上清液，進行SDS-PAGE電泳分離，將分離膠蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后將膜放入封閉液中室溫封閉2 h，加入稀釋一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，PBST洗滌3次×10 min，加入稀釋二抗(1∶5000)，室溫孵育2 h，洗滌后暗室曝光和顯影，條帶拍照后采用Image J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2灰度值與β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 注射不同時間點機械痛閾值變化 與sham組、sham+BQ123組比較，注射前BCP組、BCP+BQ123組的PWT均降低(P<0.05)，鞘內(nèi)注射后0.5～3.0 h，BCP組保持不變，BCP+BQ123組先升高后降低，于1.5 h達到最高，3.0 h恢復至注射前水平(P<0.05，表1)。

表1 4組骨癌疼痛大鼠注射治療前后PWT值比較

2.2 注射不同時間點自發(fā)抬足次數(shù)變化 與sham組、sham+BQ123組比較，注射前BCP組、BCP+BQ123組的NSF均增多(P<0.05)，鞘內(nèi)注射后0.5～3.0 h，BCP組保持不變，BCP+BQ123組先減少后增多，于1.5 h達到最少，3.0 h恢復至注射前水平(P<0.05，表2)。

表2 4組骨癌疼痛大鼠注射治療前后NSF值比較 次)

2.3 脛骨骨質(zhì)變化觀察 脛骨骨質(zhì)X線攝像顯示，sham組和sham+BQ123組脛骨骨質(zhì)密度均勻、骨皮質(zhì)連續(xù)無缺失(圖1A)；BCP組注射后14 d出現(xiàn)大范圍骨破壞、骨皮質(zhì)缺損嚴重(圖1C)；BCP+BQ123組股骨遠端見較小骨破壞病灶，部分皮質(zhì)缺損(圖1B)。

圖1 大鼠脛骨癌建模后14 d X線片

2.4 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2 mRNA表達量比較 脊髓ET1、ETAR mRNA相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ERK1/2 mRNA相對表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與sham組、sham+BQ123組比較，BCP組、BCP+BQ123組脊髓ET1、ETAR mRNA相對表達量均升高，且BCP+BQ123組低于BCP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

2.5 脊髓ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達量比較 脊髓ET1、ETAR、p-ERK1/2蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ERK1/2蛋白相對表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與sham組、sham+BQ123組比較，BCP組、BCP+BQ123組脊髓ET1、ETAR、p-ERK1/2蛋白相對表達量均升高，且BCP+BQ123組低于BCP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2和表4。

表3 4組骨癌疼痛大鼠脊髓ET1、ETAR、ERK1/2 mRNA相對表達量比較

圖2 骨癌大鼠脊髓ET1、ETAR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白免疫印跡

表4 4組骨癌疼痛大鼠脊髓ET1、ETAR、ERK1/2蛋白相對表達量比較

3 討 論

臨床調(diào)查顯示，骨癌患者及1/3惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移患者均會發(fā)生BCP，癌細胞侵襲骨骼及周圍組織，可導致劇烈疼痛，并伴隨脊柱穩(wěn)定性降低、骨折等嚴重并發(fā)癥，對患者身心均造成巨大影響[8]。目前，臨床常應用非甾體類抗生素、雙磷酸鹽等藥物控制疼痛反應，但效果多不理想，且不良反應明顯[9,10]。因此，尋找有效的治療靶點對BCP的防治有重要臨床意義。BCP發(fā)病機制復雜，其發(fā)病特征與神經(jīng)病理性疼痛相似。神經(jīng)調(diào)質(zhì)ET-1及其受體(ERAR、ERBR)廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，動物學研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ERAR、ERBR基因處于過表達狀態(tài)，提示ET-1可通過調(diào)控其受體參與疼痛的發(fā)生[11]，因此，ERAR可能成為BCP新的治療靶點。

本研究通過股骨骨髓腔接種鼠源Walker456乳腺癌細胞建立BCP模型，第14天大鼠表現(xiàn)為PWT降低和NSF增多，X線片顯示大范圍骨破壞、骨皮質(zhì)缺損嚴重，提示BCP建模成功。本研究鞘內(nèi)注射ERAR拮抗藥干預后，BCP+BQ123組的PWT先升高后降低，NSF先減少后增多，PWT和NSF均于1.5 h達到最高和最少，3.0 h恢復至注射前水平，且X線片顯示骨破壞病灶及皮質(zhì)缺損程度較BCP組減輕，提示鞘內(nèi)注射ETAR拮抗藥可有效改善BCP大鼠的疼痛反應。ET-1屬于氨基酸多肽鏈，通過自分泌或旁分泌方式，與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，ERAR是位于細胞跨膜區(qū)的ET-1受體之一，兩者廣泛表達于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)病理性疼痛反應中發(fā)揮重要調(diào)控作用[12]。ET-1在外周神經(jīng)系統(tǒng)中具有致痛作用，Tang等[13]應用ET-1誘發(fā)骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠模型，且注射ETAR拮抗藥BQ123后可逆轉(zhuǎn)疼痛行為，與本研究結(jié)果相似。骨癌或惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中，腫瘤組織通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素等刺激性神經(jīng)化學因子，激活和敏化相應受體后，將各種有害刺激通過受體轉(zhuǎn)化為電化學信號，傳入神經(jīng)元，從而導致中樞敏化、痛閾降低等[14]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，BCP組脊髓中ET1、ETAR mRNA和蛋白及p-ERK1/2蛋白表達量均升高，提示BCP疼痛反應與脊髓ET-1及ETAR上調(diào)有關(guān)，進一步鞘內(nèi)注射ERAR拮抗藥后，脊髓ET1、ETAR mRNA和蛋白及p-ERK1/2蛋白表達降低，說明ETAR拮抗藥可能通過抑制脊髓ERK通路發(fā)揮抑制疼痛反應的作用。ERK信號通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)元及突觸可塑性的重要通路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路在BCP發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，BCP發(fā)生后該信號通路處于激活狀態(tài)，而抑制該信號通路可減輕BCP疼痛反應[15]。Shenoy等[16]研究發(fā)現(xiàn)，生長抑素受體激動劑J-2156可通過抑制脊髓組織中ERK磷酸化水平而緩解BCP大鼠疼痛反應；Nakamura等[17]發(fā)現(xiàn)，過量μ-阿片受體激動劑可增加BCP小鼠ERK磷酸化水平，抑制ERK磷酸化水平可抵抗BCP小鼠疼痛效應。上述研究均說明，ERK信號通路在BCP發(fā)生及維持期間被激活。本研究鞘內(nèi)注射ERAR拮抗藥后，ETAR基因和蛋白表達水平及ERK1/2磷酸化水平均被抑制，疼痛行為學得以改善，說明ETAR拮抗藥可能通過抑制ERK1/2磷酸化水平，抑制傷害性刺激信號的傳導，阻斷其傳入初級神經(jīng)元，從而降低中樞和外周敏化，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，BCP疼痛反應與脊髓ET-1及ETAR有關(guān)，鞘內(nèi)注射ETAR拮抗藥可有效改善BCP大鼠的疼痛反應，可能通過抑制脊髓ERK通路發(fā)揮調(diào)控作用。在進一步的研究中應設(shè)計挽回實驗，證實ERAR拮抗藥與ERK信號通路的因果關(guān)系，為臨床中BCP的治療提供可靠靶點。