無菌體液分離的肺炎克雷伯菌耐藥及毒力因子研究

孫守棟 陳 燁 朱靜軒 楊雪靜

肺炎克雷伯菌易定植于腸道、呼吸道等部位，是目前臨床院內(nèi)感染及社區(qū)獲得性感染的重要病原體之一。近年來，隨著診療技術(shù)增加及廣譜抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌引起的無菌體腔感染越來越受到臨床重視[1～3]?，F(xiàn)國內(nèi)外有關(guān)分離自無菌體液的肺炎克雷伯菌的毒力因子及耐藥性綜合分析報道較少，本研究對浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集的SBF-KP菌株的臨床分布、藥敏狀況、黏液表型、莢膜血清型及毒力基因攜帶情況進行分析，以期為臨床診治無菌體液肺炎克雷伯菌感染提供參考。

材料與方法

1.菌株來源：收集浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院2017年8月～2019年12月無菌體液標(biāo)本(胸腹腔積液、膿液、膽汁、腦脊液、關(guān)節(jié)腔積液、骨髓等，不包括血液及尿液)分離的肺炎克雷伯菌83株，剔除同一患者重復(fù)菌株。無菌體液：在標(biāo)本采集、標(biāo)本處理過程中嚴格無菌操作，分離出的細菌被認為是感染菌的液體標(biāo)本。

2.儀器與試劑：MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Bruker)、Vitek-2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)、PCR 儀(美國 Bio-Rad 公司)、10×AceTaq PCR Buffer(含Mg+2)及PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、電泳儀及紫外凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)、細菌核酸提取盒[天根生化科技(北京)有限公司]、PCR擴增引物合成及產(chǎn)物測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

3.菌株鑒定及藥敏試驗：按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行無菌體液標(biāo)本采集與細菌分離培養(yǎng)，陽性菌株采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀及Vitek-2 Compact 系統(tǒng)進行細菌鑒定及藥敏試驗(質(zhì)譜儀鑒定率需達到2.0以上)。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，藥敏結(jié)果采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLIS)推薦標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。

4.高黏液型鑒定：用接種環(huán)挑取血平板待測菌株，挑起的黏液絲長度≥5mm，為黏液絲試驗陽性，重復(fù)3次以上確定為高黏液菌株。

5.PCR擴增及序列分析：對無菌體液分離的肺炎克雷伯菌常見莢膜型K1、K2、K57、K5、K20、K54基因及uge、wabG、ycf、ureA、fimH、rmpA、rmpA2、aerobactin、iucA、magA、wcaG、ybtA、kfuB、iroB、alls、iutA、entB毒力基因進行PCR擴增及序列分析。反應(yīng)條件、反應(yīng)體系、引物合成參照文獻[4～7]。PCR擴增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，序列與GenBank數(shù)據(jù)庫在線比對。

6.統(tǒng)計學(xué)方法：采用WHONET 5.6軟件剔除重復(fù)株后進行藥敏結(jié)果統(tǒng)計分析，采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，樣本率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.標(biāo)本來源：共收集SBF-KP菌株83株，其中膿液的檢出率最高，為47.0%(39/83)；其次為腹腔積液、膽汁、胸腔積液穿刺液、腦脊液、骨髓，分別為21.7%(18/83)、16.9%(14/83)、7.2%(6/83)、6.0%(5/83)和1.2%(1/83)。

2.藥敏結(jié)果：83株SBF-KP對臨床14種抗菌藥物均有不同程度耐藥，其中對復(fù)方新諾明、氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸、左旋氧氟沙星耐藥率較高，均大于20%；對替加環(huán)素、阿米卡星、碳青霉烯類具有較好的藥物敏感度，耐藥率分別為6.0%(5/83)、7.2%(6/83)、9.6%(8/83，表1)。

表1 無菌體液分離的肺炎克雷伯菌藥敏試驗結(jié)果

3.莢膜型及高黏液型分布：SBF-KP菌株莢膜型以K1、K2型為主，陽性率分別為39.8%(33/83)、13.3%(11/83)，檢測到1株K5莢膜型SBF-KP菌株。SBF-KP高黏液型陽性率為57.9%(48/83)，高黏液型菌株K1、K2莢膜型陽性率分別為45.8%(22/48)、18.8%(9/48)。

4.毒力基因檢測：17種毒力基因中entB、fimH、uge、wabG、ureA、ycf基因檢出率最高，均大于98.0%；其余毒力基因均有檢出，其中iroB檢出率最低，為9.6%(8/83，表2，圖1)。

圖1 rmpA2基因電泳圖

表2 無菌體液分離肺炎克雷伯菌毒力因子分布

5.無菌體液中膿液與其他無菌體液毒力因子差異：48株高黏液型菌株中，膿液、其他無菌體液分離的菌株分別為34、14株；膿液標(biāo)本與其他無菌體液在高黏液表型、rmpA、aerobactin、kfuB檢出率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

高黏液表型是高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)最主要的毒力特征之一，黏液表型調(diào)解因子A(rmpA、rmpA2)對維持菌株高黏液型具有重要意義；rmpA、rmpA2位于180～220kb的質(zhì)粒上，可協(xié)同鐵載體等其他毒力因子調(diào)控菌株毒力表達。本研究SBF-KP菌株rmpA、rmpA2基因陽性率較既往HvKP研究低，且菌株高黏液表型與rmpA、rmpA2基因陽性率不一致，部分攜帶黏液表型調(diào)解因子A菌株并不表達高黏液表型，考慮可能與氣桿菌素(aerobactin)、wcaG、rfbP等毒力因子基因缺失有關(guān)[10,11]。另外本研究發(fā)現(xiàn)，無菌體液中膿液標(biāo)本的高黏液表型陽性率高于其他無菌體液，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，猜測可能與rmpA基因調(diào)控有關(guān)。莢膜多糖過度分泌可使肺炎克雷伯菌呈高黏液表型，根據(jù)莢膜多糖可將肺炎克雷伯菌分為82種莢清型，其中K1、K2型毒力較強且與HvKP密切相關(guān)[12,13]。magA位于染色體上，與肺炎克雷伯菌K1莢膜型合成相關(guān)，alls基因主要編碼尿囊素調(diào)節(jié)因子激活劑，并且與氣桿菌素的生成密切相關(guān)，wcaG基因主要編碼菌株莢膜中的巖藻糖成分，有助于逃避吞噬細胞的吞噬作用。本研究發(fā)現(xiàn)SBF-KP菌株莢膜型以K1/K2高毒型為主，比例大于50%，且alls、magA基因僅存在于K1型肺炎克雷伯菌中，與相關(guān)報道一致[14,15]。席健峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)wcaG基因僅存在K1型肺炎克雷伯菌中，本研究中wcaG在K1、K2型以及未分型菌株均有檢出，與其結(jié)果不符。

肺炎克雷伯菌鐵攝取相關(guān)毒力因子(aerobactin、iutA、iucA、ybtA、entB、iroB、kfuB、ycf)對維持菌株定植、侵襲、高毒性具有重要作用，其中氣桿菌素aerobactin因子是其最主要的毒力因子[17]。Yu等[6]研究發(fā)現(xiàn)K1、K2 莢膜型肺炎克雷伯菌aerobactin的檢出率為 100%，本研究K1、K2 莢膜型肺炎克雷伯菌均攜帶aerobactin基因，與其報道一致。iucABCD是氣桿菌素的基因編碼簇，本研究iucA與rmpA基因陽性率稍有差別，與iucABCD、rmpA基因位于同一質(zhì)粒報道不符[18]。kfuB是肺炎克雷伯菌鐵離子轉(zhuǎn)運受體，與菌株高毒力密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)K1型肺炎克雷伯菌均攜帶kfuB基因，與kfu基因在K1型菌株檢出率較高一致[19]。rmpA、iucABCD-iutA基因?qū)旮叨玖?、高致死力具有重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)高黏液K1/K2型菌株感染均攜帶rmpA、iucA、iutA毒力基因，且患者預(yù)后不佳，提示rmpA、iucA、iutA基因可能與K1/K2型菌株的高毒性、高致死性密切相關(guān)[6，20]。本研究SBF-KP菌株entB、fimH、uge、wabG、ureA、ycf基因檢出率大于98.0%，且無菌體液膿液標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌aerobactin、kfuB基因陽性率高于其他無菌體液，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，SBF-KP菌株對臨床常用抗菌藥物具有不同程度耐藥，對阿米卡星、替加環(huán)素、碳青霉烯類藥物仍有較好的藥物敏感度；另外SBF-KP菌株攜帶多種毒力因子，且莢膜血清型以K1型、K2型為主，提示臨床應(yīng)進一步加強耐藥監(jiān)測，結(jié)合菌株藥敏合理選用抗生素，以提高療效及減少高毒力和高耐藥菌株的傳播和流行。