布魯菌蛋白抗原的研究進(jìn)展

肖林萍 蘭英華

布魯菌病是一種人獸共患傳染病，有多種臨床表現(xiàn)，如波狀熱、多汗、肝脾腫大、淋巴結(jié)腫大、關(guān)節(jié)炎、睪丸炎等，累及多個(gè)系統(tǒng)，由于缺乏特異性表現(xiàn)和敏感度較高的診斷方法，極易造成誤診、漏診，貽誤治療。目前布魯菌血清學(xué)診斷方法主要應(yīng)用布魯菌脂多糖(LPS)作為診斷性抗原，但此抗原與耶爾森菌、志賀菌、霍亂弧菌的成分存在交叉反應(yīng)，易造成假陽性，而且在患者痊愈后數(shù)月甚至數(shù)年檢驗(yàn)結(jié)果仍可能為陽性，不利于區(qū)別現(xiàn)癥感染與既往感染。因此，為準(zhǔn)確診斷布魯菌病必須找到免疫原性和免疫反應(yīng)性更強(qiáng)的布魯菌蛋白抗原。

一、外膜蛋白

布魯菌的細(xì)胞膜由3層膜結(jié)構(gòu)組成，從內(nèi)向外依次為細(xì)胞質(zhì)膜、外周胞質(zhì)膜和外膜。布魯菌的外膜是由脂多糖(LPS)、外膜蛋白(Omp)、孔蛋白共價(jià)結(jié)合于磷脂雙分子層構(gòu)成的[1,2]。布魯菌表面的蛋白最早與宿主細(xì)胞相互作用，不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，也可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[3]。目前已確定的外膜蛋白共有7種，依據(jù)相對分子質(zhì)量將其分為3組。

1.第1組外膜蛋白：相對分子質(zhì)量為10、18、19kDa，分別為Omp10、Omp16、Omp19，均為脂蛋白[2,7]。布魯菌脂蛋白可激發(fā)單核-吞噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[4,5]。韓國的一項(xiàng)研究應(yīng)用重組外膜蛋白rOmp10、rOmp19、rOmp28進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)3種蛋白抗原刺激后，RAW-264.7細(xì)胞的TNF-α和IL-6分泌水平明顯升高。分組進(jìn)行小鼠免疫接種后，發(fā)現(xiàn)抗體水平在3組免疫小鼠中均有明顯升高，而且IgG1和IgG2a水平隨著免疫時(shí)間延長而逐漸升高，說明免疫反應(yīng)由Th-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)門h-2介導(dǎo)[6]。該研究說明了Omp10、Omp19在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均具有免疫反應(yīng)性，其免疫學(xué)特性及其應(yīng)用需進(jìn)一步探究。

Alizadeh等[7]應(yīng)用重組布魯菌外膜蛋白rOmp16免疫注射小鼠發(fā)現(xiàn)IgG水平顯著升高，且免疫小鼠離體脾臟細(xì)胞經(jīng)rOmp16再次刺激后，IFN-γ和IL-4分泌水平升高。免疫4周后，人為造成免疫小鼠布魯菌感染14天，之后取小鼠脾臟細(xì)胞對布魯菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)rOmp16免疫小鼠脾臟菌落數(shù)平均為0.12 Log CFU，而未經(jīng)免疫小鼠脾臟菌落數(shù)平均為4.93 Log CFU。該研究說明了Omp16是一種潛力抗原，能夠激發(fā)顯著的抗體反應(yīng)，同時(shí)免疫小鼠分泌高水平的IFN-γ，說明rOmp16能夠激發(fā)Th1免疫反應(yīng)。

2.第2組外膜蛋白：相對分子質(zhì)量為36～38kDa，主要為Omp2，其本質(zhì)為孔蛋白。第2組外膜蛋白的編碼基因由2個(gè)基因組構(gòu)成，分別為Omp2a和Omp2b，其基因相似性超過85%[1,2]。Prachi等[8]研究顯示，rOmp2a診斷人類布魯菌病的敏感度為93.75%，特異性為95.83%，說明 Omp2a可以作為人類布魯菌病血清學(xué)診斷抗原應(yīng)用于臨床。

有研究者利用生物信息學(xué)方法預(yù)測出Omp2b的T-B細(xì)胞聯(lián)合表位，對30例布魯菌病患者進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T-B細(xì)胞聯(lián)合表位能夠誘導(dǎo)布魯菌病患者T細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ，并引發(fā)布魯菌病患者產(chǎn)生高水平特異性抗體[9]。該研究證實(shí)了Omp2b具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以作為布魯菌病的候選疫苗，也可以利用其免疫特性作為診斷性抗原。

3.第3組外膜蛋白：相對分子質(zhì)量為31～34kDa、25～27kDa，包括Omp25、Omp28、Omp31[1,2]。Yousefi等[10]對Omp25和BLS(二氧四氫蝶啶合酶)布魯菌嵌合體抗原進(jìn)行免疫評估。BLS廣泛存在于各型布魯菌細(xì)胞質(zhì)中，是一種有佐劑性質(zhì)的免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)免疫小鼠Th1和Th2免疫反應(yīng)[10,11]。該研究分組進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，其中Omp25-BLS嵌合體抗原組IgG1、IgG2a水平均高于其他實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞免疫方面,OMP25-BLS嵌合體抗原聯(lián)合HSP60組的淋巴細(xì)胞增殖數(shù)目和TNF-α分泌水平最高，說明其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答作用較強(qiáng)。

Omp28又稱Bp26，廣泛存在于各型布魯菌中，被認(rèn)為是最具潛力的血清學(xué)診斷性抗原[12～14]?，F(xiàn)有血清學(xué)診斷依賴LPS或整個(gè)細(xì)胞提取物，易造成假陽性，為突破這一瓶頸，許多研究應(yīng)用重組布魯菌抗原rOmp28進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測布魯菌。其中Thavaselvam等[13]研究發(fā)現(xiàn)，rOmp28 iELISA試驗(yàn)敏感度、特異性分別為97.50%和85.59%，點(diǎn)印跡ELISA試驗(yàn)敏感度、特異性分別為82.05%和92.43%。該方法的敏感度、特異性都比虎紅試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)高。Tiwari等[14]應(yīng)用重組布魯菌抗原rOmp28和rOmp31進(jìn)行iELISA試驗(yàn)，rOmp28診斷敏感度、特異性分別為91.6%和97.6%，rOmp31診斷敏感度、特異性分別為62.2%和94.7%。以上研究證實(shí)了Omp28診斷敏感度、特異性更高，更有潛力應(yīng)用于臨床診斷。

Omp31存在于除牛種布魯菌之外的所有布魯菌菌株中，具有免疫保護(hù)和免疫診斷潛力，是重要的免疫原性蛋白[15～17]。Zhang等[17]應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)篩選得到了Omp31的T細(xì)胞表位、B細(xì)胞表位和T-B細(xì)胞聯(lián)合表位，經(jīng)鼻黏膜免疫小鼠。經(jīng)Omp31的B細(xì)胞表位和T-B細(xì)胞聯(lián)合表位免疫后IgG1、IgG2a水平顯著升高，經(jīng)Omp31的T細(xì)胞表位和T-B細(xì)胞聯(lián)合表位免疫后呼吸系統(tǒng)淋巴結(jié)和脾臟中IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)目增多。人為應(yīng)用感染經(jīng)3類表位免疫后小鼠，小鼠體內(nèi)細(xì)菌量明顯少于陰性對照組。該研究證實(shí)Omp31的免疫原性，既可以誘導(dǎo)體液免疫，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，保護(hù)機(jī)體免受布魯菌感染。因此，可作為特異性抗原應(yīng)用于布魯菌病的診斷和新型疫苗的開發(fā)。

二、菌體蛋白

除了上述布魯菌外膜蛋白外，還有一些菌體蛋白同樣具有免疫原性，其中Cu/Zn 超氧化物歧化酶、二氧四氫蝶啶合酶(BLS)、熱休克蛋白(HSP60)已在前文中提及。

1.Ⅳ型分泌系統(tǒng)：是布魯菌毒力因子的重要組成成分，是由12 種蛋白(VirB1～VirB12)構(gòu)成的蛋白復(fù)合體，能夠幫助布魯菌躲避宿主的免疫監(jiān)視，形成持續(xù)性感染，其效應(yīng)蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，利于布魯菌在細(xì)胞之間擴(kuò)散[18]。國外一項(xiàng)研究通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選出可以被布魯菌病患者血清識別的50種蛋白質(zhì)，利用免疫表位數(shù)據(jù)庫對50 種蛋白質(zhì)進(jìn)行優(yōu)勢表位預(yù)測，應(yīng)用優(yōu)勢表位進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)。結(jié)果表明經(jīng)Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的VirB5 蛋白特定表位刺激后，急性與復(fù)發(fā)布魯菌病患者的IFN-γ水平顯著升高[19]。Mirkalantari等[20]應(yīng)用重組布魯菌抗原rVirB12對收錄的布魯菌病患者進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，該方法診斷的特異性、敏感度、準(zhǔn)確率分別為87.8%、94.0%和90.0%。以上研究表明布魯菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的VirB5蛋白能夠激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過檢測相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平可以診斷布魯菌病，并且證實(shí)了VirB12蛋白具有布魯菌血清學(xué)診斷潛力。

2.L7/L12蛋白：是布魯菌核糖體的重要組成成分，參與蛋白質(zhì)的合成過程，能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，使得CD4+T細(xì)胞增殖，IFN-γ分泌增多。Senevirathne等[21]應(yīng)用布魯菌L7/L12抗原設(shè)計(jì)了一種布魯菌疫苗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門菌分泌—轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攜帶L7/L12抗原組小鼠IgA、IgG產(chǎn)生水平顯著升高，且細(xì)胞因子IFN、IL-4分泌水平同樣顯著升高。實(shí)驗(yàn)小鼠免疫21天后，人為應(yīng)用布魯菌感染小鼠14天后，取小鼠脾臟、肝臟細(xì)胞進(jìn)行布魯菌菌落計(jì)數(shù)，免疫組小鼠的菌落計(jì)數(shù)明顯降低。以上研究說明L7/L12具有免疫原性，經(jīng)特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞或組織中，可以更加高效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而應(yīng)用于新型疫苗研發(fā)。

3.P39蛋白：是結(jié)合蛋白依賴轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一種結(jié)合蛋白，在蛋白質(zhì)折疊和應(yīng)激保護(hù)中發(fā)揮重要作用。Tadepalli等[22]應(yīng)用混合重組布魯菌抗原rOmp19+rP39進(jìn)行布魯菌感染小鼠體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)免疫后小鼠體內(nèi)抗體水平升高，且以Th1免疫反應(yīng)介導(dǎo)的亞型IgG2a為主。分離免疫小鼠脾臟細(xì)胞，rOmp19+rP39聯(lián)合免疫組小鼠IFN-γ、IL-2、IL-12分泌水平高于rOmp19免疫組和rP39免疫組。該研究說明Omp19+P39混合抗原具有高度免疫原性，能夠激發(fā)Th1為主的抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)，對于疫苗的研發(fā)有重要啟示作用，同樣依據(jù)其免疫原性可以應(yīng)用于布魯菌病的血清學(xué)診斷中。

綜上所述，本文中提及的外膜蛋白(Omp)和菌體蛋白免疫原性較強(qiáng)，能夠激發(fā)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，尤其是能夠激發(fā)Th1細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ、IL-2、TNF-β等細(xì)胞因子，為宿主提供免疫保護(hù)，對于研發(fā)更高效的、可應(yīng)用于人類的布魯菌疫苗有重要意義。也有許多研究利用重組布魯菌外膜蛋白或重組菌體蛋白進(jìn)行ELISA試驗(yàn)診斷布魯菌病，診斷的準(zhǔn)確率、敏感度和特異性均較高，尤其是Omp28(Bp26)被認(rèn)為是最具潛力的血清學(xué)診斷抗原。除此之外，依據(jù)這些蛋白抗原的免疫原性，也可以通過檢測這些蛋白抗原激發(fā)細(xì)胞免疫釋放的高水平的細(xì)胞因子，從而進(jìn)行布魯菌血清學(xué)的特異性臨床診斷。應(yīng)用本文所述的布魯菌蛋白抗原，有望開發(fā)更加準(zhǔn)確、特異的布魯菌診斷方法。