甲狀腺乳頭狀癌中PDK1、ZEB1及P-cadherin的表達(dá)和臨床意義

薛棟　宋德坤　王平安　宋相孔　夏修良

【摘要】 目的：探討甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）、E盒結(jié)合鋅指蛋白1 （ZEB1）和P-鈣黏蛋白（P-cadherin）的表達(dá)情況和臨床意義。方法：選取206例PTC和45例癌旁甲狀腺標(biāo)本，采用免疫組化檢測(cè)PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達(dá)，并分析三個(gè)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平和臨床病理各參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：PTC組織中PDK1、ZEB1陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.7%、72.3%，高于癌旁甲狀腺組織的26.7%、28.9%（P<0.05）。P-cadherin在PTC組織中和癌旁甲狀腺中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.3%、88.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PDK1、ZEB1及P-cadherin表達(dá)與TNM分期、腺體外侵及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）;Spearman等級(jí)檢驗(yàn)分析，PTC組織中PDK1和ZEB1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.476，P=0.031），PDK1和P-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.419，P=0.029），ZEB1和P-cadherin蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.586，P=0.019）。結(jié)論：PTC中PDK1、ZEB1及P-cadherin蛋白的異常表達(dá)與PTC侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PDK1、ZEB1可能對(duì)PTC的診斷和治療具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】 甲狀腺乳頭狀癌 3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 E盒結(jié)合鋅指蛋白1 P-鈣黏蛋白 免疫組織化學(xué)

[Abstract] Objective： To explore the expression and clinical significance of 3-phosphoinositide dependent protein kinase 1 （PDK1），zinc finger E-box-binding protein 1 （ZEB1） and P-cadherin protein in papillary thyroid carcinoma. Method： A total of 206 cases of PTC and 45 cases of adjacent thyroid specimens were selected， the expressions of PDK1， ZEB1 and P-cadherin were detected by immunohistochemistry， the relationship between three? indicaters protein expression and clinicopathological parameters was analyzed. Result： The positive expression rates of PDK1 and ZEB1 protein in PTC were 76.7% and 72.3%， they were significantly higher than 26.7% and 28.9% in paracancerous normal thyroid tissues （P<0.05）. The positive expression rates of P-cadherin in PTC and paracancerous normal thyroid tissues were 22.3%， 88.9%， the difference was statistically significant （P<0.05）. The differences of the expression of PDK1， ZEB1 and P-cadherin protein in PTC of TNM stage， extrathyroidal invasion and lymph node metastasis were all significant （P<0.05）. Spearman rank test showed significantly positive correlation was found between PDK1 and ZEB1 （rs=0.476， P=0.031）， there was negative correlation between PDK1 and P-cadherin （rs=-0.419， P=0.029）， the similar negative correlation was between ZEB1 and P-cadherin （rs=-0.586， P=0.019）. Conclusion： The abnormal expression of PDK1， ZEB1 and P-cadherin protein in PTC is closely related to the invasion and metastasis of PTC， PDK1 and ZEB1 may have an important role in the diagnosis and theraphy of PTC.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma PDK1 ZEB1 P-cadherin Immunohistochemistry

First-authors address： The Peoples Hospital of Binzhou City， Binzhou 256610， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.003

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是普外科工作實(shí)踐過(guò)程中經(jīng)常會(huì)接觸到的一種甲狀腺癌病理類型，占80%～85%[1]。最近幾年P(guān)TC發(fā)病率呈明顯上升態(tài)勢(shì)，甚至有一部分微小乳頭狀癌病例早期就發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）是細(xì)胞分子網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)重要信號(hào)通路，它參與細(xì)胞的過(guò)度增殖、轉(zhuǎn)分化和衰亡等過(guò)程。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）是一種重要的調(diào)節(jié)因子，激活PI3K/Akt信號(hào)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)過(guò)程中起著重要的作用[3]。PDK1主要包含兩個(gè)分子結(jié)構(gòu)域，分別為PH結(jié)構(gòu)域（C端）和激酶結(jié)構(gòu)域（N端），PDK1磷酸化Akt的蘇氨酸（308位點(diǎn)）并激活PI3K/Akt信號(hào)，因此，PDK1與腫瘤細(xì)胞異常增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移都有關(guān)[4]。研究表明，急性髓細(xì)胞性白血病和乳腺癌中PDK1高表達(dá)，且與腫瘤不良預(yù)后有關(guān)[5-6]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要事件。P-鈣黏蛋白（P-cadherin）最初在1986年被發(fā)現(xiàn)，是EMT發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)經(jīng)典標(biāo)志蛋白[7]。P-cadherin是一種細(xì)胞之間鈣粘合蛋白，在維持正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化等過(guò)程中一直發(fā)揮重要生物學(xué)作用[8]。E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[9]。有研究表明，ZEB1在肺癌組織中高表達(dá)，且與病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)，ZEB1還是一個(gè)不良預(yù)后因素[10]。目前關(guān)于PDK1、ZEB1和P-cadherin在PTC中研究報(bào)道較少。本文重點(diǎn)探討PDK1、ZEB1和P-cadherin與PTC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，為探索PTC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供一個(gè)新的思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2019年6月

濱州市人民醫(yī)院206例PTC患者，男70例，女136例;年齡16～72歲，平均（44.1±6.4）歲;98例出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，108例未出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合甲狀腺乳頭狀癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn);術(shù)中留取腫瘤組織或者癌旁組織。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)與國(guó)際抗癌聯(lián)盟（AJCC）第八版進(jìn)行TNM分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整;術(shù)前接受過(guò)放射治療、化學(xué)藥物治療及免疫治療等輔助治療;合并其他組織器官癌變。選擇同一時(shí)期45例癌旁正常甲狀腺患者，男14例，女31例;年齡18～70歲，平均（42.2±5.2）歲。該研究已經(jīng)濱州市人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 應(yīng)用免疫組化方法（EnVision）檢測(cè)PDK1、ZEB1及P-cadherin蛋白表達(dá)。鼠抗人PDK1單抗、鼠抗人ZEB1單抗和鼠抗人P-cadherin單抗采購(gòu)于Santa Cruz公司，工作濃度為1∶200。EnVision試劑盒來(lái)源于Dako公司。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照用PBS。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) （1）比較PTC和癌旁甲狀腺組織中PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白的表達(dá)情況;（2）分析PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達(dá)與PTC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;（3）分析PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白三者之間的相關(guān)性。陽(yáng)性結(jié)果的判定：細(xì)胞出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性染色。PDK1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)，ZEB1蛋白定位在細(xì)胞核，P-cadherin定位在細(xì)胞膜。先判定染色的強(qiáng)度：0、1、2、3分分別對(duì)應(yīng)無(wú)色、淡黃、棕黃、棕褐色。然后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：0、1、2、3、4分分別對(duì)應(yīng)≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%和>75%以上。最后將前兩者乘積≥4分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性，而<4分為免疫反應(yīng)陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。Spearman用于相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC和癌旁甲狀腺中PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白的表達(dá) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色為PDK1，見(jiàn)圖1;細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色為ZEB1蛋白，見(jiàn)圖2;細(xì)胞膜出現(xiàn)黃染為P-cadherin，見(jiàn)圖3。PTC組織中PDK1、ZEB1蛋白的陽(yáng)性率分別為76.7%、72.3%，而癌旁正常甲狀腺組織PDK1、ZEB1蛋白陽(yáng)性率分別為26.7%、28.9%，PTC中PDK1、ZEB1的表達(dá)率均高于癌旁甲狀腺組織（P<0.05）。PTC組織中P-cadherin陽(yáng)性率為22.3%，而在癌旁甲狀腺中為88.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 PDK1、ZEB1和P-cadherin表達(dá)與PTC患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 患者臨床病理特征，如性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位和多灶性與PDK1、ZEB1和P-cadherin陽(yáng)性表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）;而PDK1、ZEB1和P-cadherin表達(dá)均與TNM分期、腺體外侵和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 PDK1、ZEB1和P-cadherin蛋白表達(dá)相關(guān)性 通過(guò)Spearman等級(jí)檢驗(yàn)分析，PTC組織中PDK1與ZEB1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.476，P=0.031），PDK1和P-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.419，P=0.029），ZEB1和P-cadherin蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.586，P=0.019）。

3 討論

甲狀腺癌在全球范圍內(nèi)均呈明顯上升態(tài)勢(shì)，目前居于我國(guó)女性惡性腫瘤的第四位[11]。近幾年P(guān)TC病例越來(lái)越年輕化，且易發(fā)生引流區(qū)域的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，大約有70%的患者確診時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此關(guān)于侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制亟待解決。

PDK1可以通過(guò)多條途徑調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性來(lái)激活A(yù)kt信號(hào)通路[12]。PDK1在喉癌組織中高表達(dá)，且其還與臨床腫瘤分期、病理學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，PDK1是喉癌患者生存預(yù)后的一個(gè)不良因素[13]。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中PDK1表達(dá)率高于癌旁組織（P<0.05），提示PDK1可能促進(jìn)了PTC的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步還研究PDK1與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PTC組織中PDK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位和多灶性沒(méi)有密切關(guān)系，而與腫瘤的TNM分期、腺體外侵和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），表明PDK1在PTC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。

ZEB1作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[14-15]。ZEB1在肺鱗癌中高表達(dá)，且和縱隔內(nèi)淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移均有關(guān)，干擾ZEB1基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲力均較前明顯下降[16]。新近的研究表明，膀胱癌和食管癌組織中均發(fā)現(xiàn)了ZEB1蛋白表達(dá)，且與臨床預(yù)后明顯相關(guān)[17]。乳腺癌中ZEB1高表達(dá)的患者容易出現(xiàn)化療耐受，且還與Bcl-xL、cyclin D1呈正相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，ZEB1在PTC中有高表達(dá)，且ZEB1表達(dá)率與TNM分期、腺體外侵和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。另外，PTC組織中PDK1與ZEB1存在正相關(guān)，推測(cè)PDK1可能通過(guò)調(diào)控ZEB1表達(dá)促進(jìn)PTC侵襲轉(zhuǎn)移。

實(shí)體惡性腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象。P-cadherin通過(guò)本身的鈣黏附作用來(lái)保持細(xì)胞間的緊密連接，一旦表達(dá)減少后導(dǎo)致黏附力下降，腫瘤細(xì)胞就會(huì)容易侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。EMT在PTC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中出現(xiàn)P-cadherin低表達(dá)，并且35例肝癌完全沒(méi)有表達(dá)，P-cadherin還與腫瘤分期明顯有關(guān)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制P-cadherin表達(dá)，促進(jìn)了肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[21]。本研究結(jié)果顯示，PTC中P-cadherin表達(dá)明顯低于癌旁甲狀腺組織（P<0.05）。P-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與患者TNM分期、腺體外侵及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有關(guān)（P<0.05）。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，PDK1和P-cadherin存在負(fù)相關(guān)，P-cadherin和ZEB1存在負(fù)相關(guān)。PDK1、ZEB1和P-cadherin在PTC中有異常表達(dá)的現(xiàn)象，且三者有相關(guān)性，提示三者參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

綜上所述，PTC中PDK1、ZEB1高表達(dá)伴有P-cadherin低表達(dá)，且三個(gè)指標(biāo)均與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺體外侵明顯相關(guān)。但是關(guān)于PDK1促進(jìn)PTC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不明確，仍需要深入研究。

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（收稿日期：2020-10-12） （本文編輯：程旭然）