紅景天苷調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)永久性腦缺血大鼠的保護(hù)作用

黃嘉慧，趙春蕊，聶婧雯，羅 銳，黃私迎，孫春曉，楊澤霖，應(yīng) 雄，洪桂祝，賴文芳

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

腦卒中作為世界死亡和傷殘對(duì)第二原因，具有高死亡率、致殘率和發(fā)病率。因中風(fēng)傷殘或死亡的人從1990年到2016年翻了一倍，每年新增病例有1 300多萬人。早在2017年齡標(biāo)準(zhǔn)化中風(fēng)就超過了心臟病，肺癌等其他疾病成為了中國(guó)年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡原因的榜首[1-2]。由于多種因素導(dǎo)致局部腦組織血供減少或完全中斷，腦卒中導(dǎo)致局灶性組織梗死及相應(yīng)的突發(fā)性神經(jīng)功能缺損多急性缺血性腦卒中占中國(guó)腦卒中的69.6%-70.8%[3-4]。然而幸存者仍然有著極高的致殘風(fēng)險(xiǎn)，需要短期或長(zhǎng)期的康復(fù)，造成了巨大的人力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。

紅景天為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，有益氣活血，通脈平喘之功效，其中，紅景天苷( salidroside,Sal) 是紅景天的主要有效成分，具有增強(qiáng)記憶、改善心腦血管系統(tǒng)功能等多種藥理作用[6]。本團(tuán)隊(duì)致力于紅景天苷藥物研發(fā)，前期研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷(tMCAO)的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制，闡明紅景天苷能夠降低梗死面積，修復(fù)神經(jīng)功能損傷，對(duì)tMCAO大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-13]。由于新藥的研發(fā)在臨床前藥效學(xué)研究階段,需要兩種以上動(dòng)物模型的研究，課題組也研究了紅景天苷對(duì)永久性腦缺血(pMCAO)大鼠的作用，并明確紅景天苷能夠降低pMCAO大鼠腦梗死體積[8]，但對(duì)pMCAO大鼠作用的具體機(jī)制尚不明確，因此，本文將進(jìn)一步探索紅景天苷對(duì)pMCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物70只SPF級(jí)雄性SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購入)，體質(zhì)量(220±20)g，按照SPF級(jí)規(guī)范，恒定濕度和溫度，不禁食，不禁水，適應(yīng)性飼養(yǎng)(福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng))。上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：2015000509563，許可證號(hào)：SCXK(滬)2015-0002；福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號(hào)：SYXK(閩)2015-0005。

1.2 藥品與主要試劑紅景天苷(福建中醫(yī)藥大學(xué)，純度98%)；β-actin抗體(貨號(hào)：H015)，來自碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG(貨號(hào)：ab7064)、TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG(貨號(hào)：ab6718)、NeuN抗體(貨號(hào)：AB51005)，均來自英國(guó)Abcam公司；SYBR Select Master Mix(美國(guó)Applied Biosystem公司，批號(hào)：4472908)；NF-κB p50抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-166588)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica公司；7900H-PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Biorad公司；ND2000C紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；3600AAA尼龍線栓，廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；Nikon DS-Ril生物數(shù)碼顯微鏡，尼康儀器有限公司。

2 方法

2.1 pMCAO模型大鼠制作本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參照Zea Longa的方法進(jìn)行pMCAO模型大鼠的制備。禁食SD大鼠12 h后，使用腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉，于頸部沿中線切開，分離頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，選擇頸總動(dòng)脈開口并用線栓插入，上行至Willis環(huán)，至稍感阻力，固定線栓，按要求消毒縫合切口。假手術(shù)組不插入線栓，其余手術(shù)操作同上。待大鼠清醒參照Longa法[14]對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分與神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)：0分為無神經(jīng)損傷；1分為無法完全伸出缺血側(cè)前爪；2分為向缺血側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向缺血側(cè)傾斜；4分為失去知覺計(jì)或喪失自主行走能力，評(píng)分在2-3分視為模型成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(pMCAO組)、給藥組(pMCAO+Sal組)，大鼠采用線栓法造模成功后，照常飼養(yǎng)，對(duì)sham組和pMCAO組大鼠按照10 mL·kg-1·d-1腹腔注射0.9%生理鹽水，pMCAO+Sal組按照50 mg·kg-1·d-1腹腔注射紅景天苷[15]，給藥1 d后，取材。

40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(pMCAO組)、給藥組(pMCAO+Sal組)、抑制劑組(pMCAO+Sal+LY組)；調(diào)節(jié)腦立體定位儀進(jìn)行定位左側(cè)腦室：以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，頭尾方向向后移動(dòng)0.9 mm，左側(cè)移動(dòng)1.5 mm，深度為3.5 mm，注射10 μL 10 mmol·L-1的PI3K抑制劑 LY294002后(LY294002用含25% DMSO的PBS溶解)，側(cè)腦室注射30 min后，制備pMCAO模型，1 h后，腹腔注射生理鹽水或紅景天苷，給藥1 d后取材。

2.3 Western blot分析腦組織中蛋白的表達(dá)水平提取大鼠缺血側(cè)大腦總蛋白進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，用SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離后，轉(zhuǎn)移凝膠上的蛋白至PVDF膜上。5%BSA封閉2 h，加入一抗，NeuN稀釋比例為1 ∶800，NF-κB p50稀釋比例為1 ∶800，β-actin稀釋比例為1 ∶3 000，4 ℃搖床孵育12 h。使用TBST洗滌3次，每次10 min后，于按比例稀釋的二抗中室溫孵育2 h，使用TBST洗滌3次，每次10 min。按比例配置ECL顯色劑，行ECL顯色劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)顯影，分析目標(biāo)條帶的灰度值。

2.4 RT-qPCR 檢測(cè)IL-6，TNF-αmRNA表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)。參照GenBank中大鼠 IL-6、TNF-α的引物序列，IL-6 引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′，下游序列 5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 129 bp；TNF-α 引 物 上 游 序 列 5′-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3′；下游序列5′-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3′，PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 149 bp;GAPDH 引物上游序列 5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列 5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為96 bp。

2.5 免疫組織化學(xué)(IHC)染色測(cè)定腦組織中NeuN 的表達(dá)大鼠給藥1 d后，2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，于心尖處插入灌注針至左心室，并迅速剪開右心耳以形成灌注液排除通道，從左心室快速灌注生理鹽水250 mL后，再灌注4%多聚甲醛2 h，然后迅速取腦組織置4%多聚甲醛中固定24 h。使用腦膜將全腦冠狀均等分成6片，進(jìn)行脫水、石蠟包埋及切片。腦組織切片進(jìn)行熒光染色后使用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，記錄結(jié)果，并用ZEN LIGHT軟件檢測(cè)熒光信號(hào)。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對(duì)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN的作用免疫熒光染色結(jié)果顯示，與sham組比較，pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN表達(dá)明顯減低，經(jīng)Sal作用后，其能夠明顯促進(jìn)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN表達(dá)量，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，Western blot結(jié)果表明，與sham組比較，pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN蛋白表達(dá)降低，經(jīng)Sal作用后，pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN蛋白明顯增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 1。

3.2 紅景天苷對(duì)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織Akt的作用Western blot結(jié)果表明，與sham組比較，pMCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織Akt蛋白的磷酸化水平表達(dá)明顯減少，經(jīng)Sal作用后，pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織Akt蛋白磷酸化水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 2，同時(shí)，Sal對(duì)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織總Akt的蛋白沒有影響。

Fig 1 Effect of salidroside on NeuN immunofluorescence expression and protein in pMCAO rats*P<0.05,**P<0.01 vs sham;#P<0.05,##P<0.01 vs pMCAO

Fig 2 Effects of salidroside on Akt in pMCAO rats**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO

3.3 紅景天苷對(duì)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織核蛋白NF-κB p50和炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)影響與sham組相比，pMCAO組核蛋白NF-κB p50，及炎癥因子TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)明顯增加，經(jīng)Sal作用后，pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織核蛋白NF-κB p50、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 3。

3.4 紅景天苷對(duì)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NeuN及炎癥因子的影響本實(shí)驗(yàn)通過側(cè)腦室注射PI3K抑制劑LY294002后30 min，pMCAO造模，檢測(cè)相關(guān)蛋白及炎癥因子的表達(dá)水平。與pMCAO+Sal組比較，pMCAO+Sal+LY組p-Akt蛋白表達(dá)明顯受抑制，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 4，表明LY294002能夠抑制Sal所引起的Akt蛋白磷酸化水平；同時(shí)，檢測(cè)缺血側(cè)腦組織NeuN蛋白、核蛋白NF-κB p50和炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)，研究結(jié)果顯示，與pMCAO+Sal組比較，pMCAO+Sal+LY組，其NeuN蛋白降低，TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)明顯增加，核蛋白p50表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 5。

Fig 3 Effect of salidroside on nucleoprotein NF-κB p50,IL-6 and TNF-α mRNA in pMCAO rats**P<0.01 vs sham;#P<0.05,##P<0.01 vs pMCAO

Fig 4 Effect of salidroside on Akt protein in pMCAO rats after injection of PI3K inhibitor LY294002 into lateral ventricle**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO;△△P<0.01 vs pMCAO+Sal

Fig 5 Effects of salidroside on NeuN protein,nucleoprotein NF-κB p50 and inflammatory markers in pMCAO rats after injection of PI3K inhibitor LY294002 into lateral ventricle**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO;△△P<0.01 vs pMCAO+Sal

4 討論

PI3K/Akt通路作為一條經(jīng)典且作用廣泛的信號(hào)途徑，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等諸多方面。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Sal能有效減少pMCAO大鼠大腦梗死體積[8]，抑制炎癥因子，故本實(shí)驗(yàn)通過抑制PI3K來研究PI3K/Akt信號(hào)通路及對(duì)Sal作用的影響，深入探討Sal的藥理的分子作用機(jī)制。目前，PI3K抑制劑包括單純PI3K抑制劑(Pan-PI3K Inhibitors)和選擇性PI3K抑制劑Selective PI3K Inhibitors)兩種。本實(shí)驗(yàn)采用廣泛應(yīng)用的LY294002進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。LY294002是一種分子量大小為307.34的化合物，屬于單純PI3K抑制劑，可同時(shí)抑制p110α、p110β和p110δ 3個(gè)亞型，使下游多條信號(hào)通路失活，已廣泛用于腦缺血損傷機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)通過側(cè)腦室注射PI3K抑制劑LY294002l對(duì)pMCAO大鼠腦內(nèi)PI3K/Akt通路阻斷后，進(jìn)而研究其對(duì)Sal的神經(jīng)保護(hù)作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在pMCAO大鼠中，Sal可促進(jìn)pMCAO大鼠缺血側(cè)腦組織Akt蛋白的磷酸化水平，增加NeuN蛋白表達(dá)，抑制核蛋白NF-κB p50的核轉(zhuǎn)錄水平，抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA水平，表明Sal可能通過激活PI3K/Akt通路，抑制NF-κB p50的核轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制炎癥因子表達(dá)，上調(diào)神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN蛋白表達(dá)。通過側(cè)腦室注射PI3K抑制劑LY294002后，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑LY294002能夠逆轉(zhuǎn)以上Sal的干預(yù)作用，表明在pMCAO模型中，Sal的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制NF-κB核轉(zhuǎn)錄與炎癥因子的表達(dá)，上調(diào)神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上，Sal能夠通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制NF-κB p50核轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而抑制炎癥因子，進(jìn)而對(duì)pMCAO模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)的作用。