W3D通過調(diào)控TLR4/MD2-NF-κB p65信號通路改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

史新陽，高曉慧，趙 蓓，唐 莉，李青山,2

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001；2.基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點實驗室，山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由創(chuàng)傷、感染等多種因素引起的疾病，臨床表現(xiàn)主要有胸悶、氣短、氣促、咯血等，發(fā)展至嚴(yán)重階段可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征，病死率達(dá)30%-45%[1]。ALI的主要發(fā)病機(jī)制與過度失控的炎癥反應(yīng)，繼而引起炎性細(xì)胞浸潤及多種炎癥因子過度表達(dá)密切相關(guān)[2]。作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，能夠誘導(dǎo)TLR4/MD2-NF-κB信號通路活化，啟動細(xì)胞內(nèi)炎性信號的傳導(dǎo)[3]而誘發(fā)炎癥，其中TLR4/MD2復(fù)合體可特異性識別促炎信號LPS，激活NF-κB的入核，啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，合成促炎因子，誘發(fā)ALI。目前，ALI的治療仍以舒血管藥、抗氧化劑、糖皮質(zhì)激素、抗炎藥為主[4]，其中抗炎藥的應(yīng)用在ALI治療中占據(jù)重要地位，然而僅僅依靠使用一種或幾種抗炎藥物治療尚難以有效遏制ALI的發(fā)生和發(fā)展[5]。因此，研發(fā)新型高效ALI治療藥物仍是目前亟待解決的重大課題。

苯并噁唑類化合物由于其所具有的多種生物學(xué)活性而成為新藥設(shè)計合成中重要的醫(yī)藥中間體，其中以氯唑沙宗(5-氯-2-苯并噁唑酮)為代表的苯并噁唑酮類化合物則呈現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用，且大量文獻(xiàn)已證明取代位置的差異會影響其生物活性，例如N-取代后，化合物往往呈現(xiàn)出抗結(jié)核分枝桿菌[6]、抗焦慮[7]、選擇性激動毒蕈堿型m1受體[8]等活性，6位取代后化合物具有一定的細(xì)胞毒性，呈現(xiàn)出抗腫瘤潛力[9]。課題組以4位為衍生位點，設(shè)計合成了系列4-取代苯并噁唑酮衍生物[10-11]，發(fā)現(xiàn)化合物4-(5’-二甲氨基)-萘磺酰氧基苯并噁唑酮(4-(5′-dimethylamino)-naphthalenesulfonyl-2(3H)-benzoxazolone，W3D)具有高效體外抗炎活性，其對LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞NO的IC50值為17.67 μmol·L-1，對IL-6的IC50值為8.608 μmol·L-1，對IL-1β的IC50值為20.07 μmol·L-1，與臨床用藥塞來昔布活性(NO- IC50為17.89 μmol·L-1，IL-6- IC50為36.04 μmol·L-1，IL-1β- IC50為17.94 μmol·L-1)相當(dāng)[12]。然而，化合物W3D能否改善LPS誘導(dǎo)的ALI，作用機(jī)制如何未知。本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的ALI模型，測定小鼠肺部病理組織改變，血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)以及肺組織中TLR4、MD2、p-IRAK4、p65的表達(dá)來評價化合物W3D的抗ALI活性及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑W3D(批號：20200520，山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室提供，純度≥98%)；LPS(北京索萊寶科技有限公司)；氯唑沙宗(批號：C10403818，麥克林試劑，純度98%)；TLR4抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；MD2抗體(Abcame公司)；MPO試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)；HRP二抗、RIPA裂解液等其他試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物健康ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，清潔級，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(晉)2019-0004。飼養(yǎng)條件：25℃±2℃，自由進(jìn)食飲水。

1.3 儀器全波長多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；TGL-16gP高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；漩渦混懸器(北京大龍儀器)；702型超低溫冰箱(美國Thermo公司)；400S型超聲波清洗機(jī)(深圳超潔科技實業(yè)有限公司)；超純水儀(力康集團(tuán))；水浴鍋(國華電器)。

2 方法

2.1 動物處理取48只ICR小鼠，隨機(jī)分為對照組，模型組，氯唑沙宗組(12.5 mg·kg-1)，W3D組(3.125、6.25、12.5 mg·kg-1)，每組8只。4%水合氯醛麻醉小鼠后，除對照組氣道滴入生理鹽水外，其余各組按2.5 mg·kg-1劑量[13]，于氣道滴入LPS，4 h后給藥，12 h后麻醉小鼠，放血處死取出肺臟。

2.2 小鼠肺濕干比計算取小鼠右肺組織，濾紙吸干表面水分稱取濕重(wet wt，wwt)，置50 ℃烘箱48 h至恒重，稱取干重(dry wt，dw)，計算肺濕干比(wet/dry ratio，wwt/dw)。

2.3 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化生理鹽水洗凈肺臟，去除血漬，并置于濾紙上吸干表面水分，剪下左上肺后固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.4 試劑盒法檢測MPO活性取小鼠肺臟與生理鹽水按體積比1 ∶9勻漿，并按照說明書操作，在450 nm處測定吸光度值，計算MPO活性。

2.5 ELISA法測定小鼠血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β含量小鼠麻醉后，放血處死，血液室溫放置1 h后，3 000 r·min-1離心15 min，取上清即得血清。按說明書操作測定小鼠血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 Western blot法檢測TLR4、MD2、p-IRAK4、p65的蛋白表達(dá)取肺組織100 mg，RIPA提取總蛋白并定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗后成像，ImageJ軟件分析灰度。

3 結(jié)果

3.1 化合物W3D對小鼠肺組織形態(tài)與肺濕干比的影響LPS造模后，與對照組相比，模型組小鼠肺組織明顯水腫，并出現(xiàn)嚴(yán)重充血現(xiàn)象，W3D作用后肺組織水腫及充血現(xiàn)象較模型組明顯減輕。肺組織濕干比結(jié)果如Fig 1所示，模型組較對照組相比濕干比顯著提高，給藥組濕干比明顯降低，且呈一定的劑量依賴性，當(dāng)給藥劑量為6.25 mg·kg-1時即具有顯著性差異。

Fig 1 Effects of compound W3D on lung wwt/dw ##P<0.01 vs control,*P<0.05 vs LPS group

3.2 化合物W3D對小鼠肺組織病理學(xué)的影響如Fig 2所示，對照組肺組織未見病理改變；模型組則出現(xiàn)局部肺泡腔結(jié)構(gòu)不清，大量粒細(xì)胞浸潤(紅色箭頭)，局部出血(橙色箭頭)，血管損傷，平滑肌細(xì)胞胞核固縮深染等明顯病理改變；氯唑沙宗組肺泡壁可見粒細(xì)胞浸潤(紅色箭頭)，肺組織局部肺泡壁增厚，部分平滑肌細(xì)胞胞核固縮深染，局部可見出血；W3D作用后，低劑量(3.125 mg·kg-1)組肺組織大面積肺泡壁增厚，肺泡腔結(jié)構(gòu)不清，肺泡壁及肺泡腔內(nèi)可見大量粒細(xì)胞浸潤(黑色箭頭)，局部支氣管周圍輕度出血(黃色箭頭)，大量支氣管上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)呈空泡狀，較模型組未見明顯改善；中劑量(6.25 mg·kg-1)組肺泡腔大小不一，肺泡壁上可見大量粒細(xì)胞浸潤(紅色箭頭)，支氣管損傷，少量上皮細(xì)胞壞死，胞核固縮，胞質(zhì)呈空泡狀(黃色箭頭)，肺組織局部肺泡壁增厚，較模型組有輕度改善；高劑量(12.5 mg·kg-1)組，肺組織支氣管、肺泡壁等結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)清晰，較少粒細(xì)胞浸潤(黃色箭頭)，無血管損傷及出血等現(xiàn)象，較模型組病理學(xué)切片有明顯改善。

Fig 2 Effects of compound W3D on histopathological changes in LPS-induced lung tissues (×400)

3.3 化合物W3D對小鼠肺組織MPO活性的影響與對照組相比，LPS造模后MPO酶活性顯著提高(Fig 3)，W3D作用后MPO酶活性呈劑量依賴性降低，且當(dāng)給藥劑量為12.5 mg·kg-1時，較模型組具有顯著性差異(P<0.01)，且與氯唑沙宗組活性相當(dāng)。

Fig 3 Effects of compound W3D on lung MPO n=3)##P<0.01 vs control,**P<0.01 vs LPS group

3.4 化合物W3D對小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS含量的影響模型組TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS含量明顯升高(Fig 4)，化合物W3D作用后TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS呈劑量依賴性降低，尤其對TNF-α，IL-6和IL-1β的抑制活性明顯優(yōu)于氯唑沙宗組，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 4 Effect of compound W3D on TNF-α, IL-6,IL-1β,iNOS in mouse n=6)##P<0.01 vs control,*P<0.05 ,**P<0.01 vs LPS group

3.5 化合物W3D對TLR4、MD2、p-IRAK4、p65蛋白表達(dá)的影響模型組小鼠肺組織TLR4、MD2、p-IRAK4、p65蛋白水平與對照組相比明顯增高；W3D作用后，TLR4、MD2和p65的蛋白表達(dá)明顯降低，且IRAK4的磷酸化水平明顯減弱，并呈現(xiàn)劑量依賴性(Fig 5)。

Fig 5 Effects of W3D on expression levels of relative proteins in LPS-induced ALIA:The Western blot results of protein TLR4,MD2,p-IRAK4,and p65;B:The relative quantity of TLR4,MD2,p-IRAK4,and p65 to that of β-actin (compared with the control group) n=3)##P<0.01 vs control,**P<0.01 vs LPS group

4 討論

氯唑沙宗是一種經(jīng)典的用于軟組織損傷、筋膜炎等疾病的解熱鎮(zhèn)痛藥物[14]，其活性與有效抑制iNOS的表達(dá)密切相關(guān)?；衔颳3D是以氯唑沙宗為骨架，經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后獲得的新型苯并噁唑酮衍生物，且已證明其體外抗炎鎮(zhèn)痛活性優(yōu)于氯唑沙宗[15-16]，但該類骨架結(jié)構(gòu)化合物對于肺炎的治療是否有效未見文獻(xiàn)報道。因此，我們建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型，通過測定小鼠肺部病理組織改變以及血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)來評價化合物對ALI的治療作用。結(jié)果顯示氯唑沙宗與化合物W3D均可抑制血清中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，改善ALI。同時實驗結(jié)果也進(jìn)一步驗證了氯唑沙宗與iNOS的作用，較炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β，氯唑沙宗對iNOS的抑制作用更加明顯，化合物W3D與氯唑沙宗相比，在具有同樣高效iNOS抑制作用的同時，對炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表現(xiàn)出了更為明顯的抑制活性，尤其是對炎癥因子IL-6的抑制活性(78.85%)與同等劑量的塞來昔布(34.06%)相比，表現(xiàn)出一定的治療優(yōu)勢。

與此同時，我們發(fā)現(xiàn)該類結(jié)構(gòu)化合物對MPO表現(xiàn)出顯著的抑制作用，而MPO的表達(dá)與巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，引起中性粒細(xì)胞的趨化和活化有關(guān)[17]。課題組前期已證實，化合物W3D可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子的釋放，且其作用與調(diào)控TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)[12]。本研究中再次測定了TLR4、MD2、p-IRAK4蛋白的表達(dá)，且結(jié)果顯示化合物W3D可顯著抑制肺組織中TLR4、MD2蛋白的表達(dá)，抑制IRAK4的磷酸化。作為NF-κB通路中重要的轉(zhuǎn)錄子，p65蛋白可與基因啟動子或增強(qiáng)子特異性結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄，也是NF-κB信號通路激活的關(guān)鍵蛋白[18]。本研究也進(jìn)一步證實了化合物W3D可劑量依賴性抑制p65蛋白的表達(dá)，結(jié)果與體外實驗結(jié)果一致。我們的實驗結(jié)果不僅證明了該類化合物可通過抑制iNOS發(fā)揮抗炎作用，也揭示了其對TLR4-NF-κB信號通路的調(diào)控是發(fā)揮活性的又一重要作用機(jī)制，為該類結(jié)構(gòu)化合物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供一定的理論基礎(chǔ)。

綜上，本實驗結(jié)果表明，化合物W3D可通過調(diào)控TLR4/MD2-NF-κB p65信號通路改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，而苯并噁唑酮結(jié)構(gòu)具有成為ALI治療藥物研究重要骨架的潛力，為進(jìn)一步抗ALI藥物的研發(fā)提供了重要依據(jù)。