李 楠,杜怡婷,馬 鑫,李冬梅
(華北理工大學(xué)藥學(xué)院,河北唐山 063210)
中藥是中華民族的瑰寶,是中國(guó)特色和文化自信的組成部分.中藥品質(zhì)是中藥臨床用藥安全有效的基礎(chǔ),亦是保障中藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的生命線,直接關(guān)乎中藥標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化發(fā)展.中藥質(zhì)量控制具有一定難度,這是因?yàn)橹兴幎嗑咭詮?fù)方制劑和多成分給藥的特點(diǎn),即“多組分、多靶點(diǎn)和多通路”[1],其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也從過(guò)去的定性鑒別為主,發(fā)展到同時(shí)測(cè)定多成分、多靶點(diǎn)的整體質(zhì)量評(píng)價(jià).近年來(lái),一測(cè)多評(píng)法、中藥指紋圖譜技術(shù)、快速檢測(cè)技術(shù)和仿生技術(shù)等多種現(xiàn)代分析方法和技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制研究[2],使其朝著標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化和全面化的方向發(fā)展.
中藥色譜指紋圖譜技術(shù)指中藥經(jīng)適當(dāng)前處理后,采用色譜分析方法,得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖[3].該技術(shù)能夠很好地反映中藥品質(zhì)的真實(shí)性、一致性和穩(wěn)定性,得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍認(rèn)可.為進(jìn)一步將中藥所含化學(xué)成分和其藥效相關(guān)聯(lián),建立能夠通過(guò)色譜指紋圖譜而預(yù)測(cè)其藥效的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)新模式[4],譜效關(guān)系的研究應(yīng)運(yùn)而生[5-6].有關(guān)中藥譜效關(guān)系的研究論文不多,柯昌虎等[7]從色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜和聯(lián)用技術(shù)指紋圖譜等方面對(duì)金銀花指紋圖譜的研究方法進(jìn)行歸納總結(jié),為制定科學(xué)可靠的金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供依據(jù);王常瞵等[8]對(duì)中藥黃芩色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜和生物指紋圖譜的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為合理評(píng)價(jià)和控制黃芩藥材品質(zhì)提供依據(jù).
雙黃連是一味由金銀花、黃芩和連翹組成的中成藥,具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效,作為臨床常用藥,具有廣泛的抗菌、消炎和解毒作用,如抑制肺炎雙球菌,治療小兒支原體肺炎、小兒皰疹性咽峽炎,治療口腔潰瘍甚至有抗結(jié)腸癌的活性等[9].目前,尚未見雙黃連指紋圖譜和譜效關(guān)系方面的綜述報(bào)道.為了建立全面、系統(tǒng)的雙黃連質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系,以指導(dǎo)其臨床用藥.本文從不同劑型雙黃連樣品的前處理方法,不同色譜分析方法對(duì)其色譜指紋圖譜的研究方法進(jìn)行歸納整理,分析目前雙黃連譜效關(guān)系研究進(jìn)展,并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望.
臨床常用雙黃連劑型有口服液、注射劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑和凝膠劑等,不同劑型的樣品前處理方法略有不同.
雙黃連口服液型樣品前處理方法主要是通過(guò)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或稀釋、過(guò)濾后備用.如陳?。?0]將400μL雙黃連口服液置于25 mL的容量瓶中并加入體積分?jǐn)?shù)為50%(文中如無(wú)特殊說(shuō)明時(shí)均為體積分?jǐn)?shù))甲醇溶劑,超聲20 min后室溫放置,再次加入50%甲醇定容后搖勻,以此作為供試品備用.馮宏玲等[11]取10支雙黃連口服液混合,量取500μL混合液置于10 mL容量瓶中,同樣加入50%甲醇進(jìn)行定容,搖勻后用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行濾過(guò);王新宏等[12]取雙黃連口服液5支,混勻后量取500μL用50%甲醇定容至10 mL,作為供試品溶液備用.
雙黃連凍干粉類注射劑型通常需要經(jīng)溶劑溶解,之后前處理方法類似于口服液的處理方法.如郭潔等[13]選擇雙黃連凍干粉制備供試品溶液,取適量樣品至10 mL容量瓶,用30%甲醇定容,超聲分散備用;Luan等[14]直接將雙黃連注射液經(jīng) 0.45 μm尼龍膜過(guò)濾后,進(jìn)行樣品分析;Zhang等[15]首先用50%甲醇稀釋雙黃連注射液,再以0.22 μm濾膜進(jìn)行濾過(guò)后備用.
雙黃連片劑型樣品前處理方法是通過(guò)對(duì)樣品研磨、超聲溶解和過(guò)濾后備用.如唐佩琴[16]取雙黃連片劑研細(xì)后,稱質(zhì)量為1.0 g,置于50 mL棕色容量瓶中并加入60%甲醇,恒溫超聲45 min后,待樣品溫度降至室溫,繼續(xù)加60%甲醇定容并搖勻、過(guò)濾后備用;趙洪濤等[17]取20片雙黃連片劑于研缽中研細(xì),稱取粉末0.2 g,用50%甲醇/水溶解,超聲30 min后,再用50%甲醇/水補(bǔ)齊溶液至10 mL,0.45 μm濾膜過(guò)濾,得到待分析供試品溶液.
雙黃連顆粒劑型樣品前處理方法類同于片劑.如周志等[18]取3袋雙黃連顆粒的內(nèi)容物,研細(xì)后,稱取1.0 g,置具塞錐形瓶中,加50%甲醇并超聲處理20 min,最后用 0.45 μm濾膜過(guò)濾備用;高利利等[19]也是將雙黃連顆粒研細(xì)后,采用溶劑溶解,過(guò)濾除雜等,制得待測(cè)樣品.
雙黃連膠囊劑型樣品在分析時(shí)取膠囊內(nèi)的內(nèi)容物,后續(xù)樣品處理方法與片劑和顆粒劑類似,也可采用溶劑回流提取的樣品前處理方法.如王建會(huì)和孫國(guó)祥[20]取5粒雙黃連膠囊的內(nèi)容物,稱質(zhì)量后置于25 mL容量瓶中,甲醇溶解,超聲分散30 min后冷卻至室溫,再用甲醇定容至刻度,離心后取上清液,用0.45 μm濾膜過(guò)濾得到待測(cè)溶液;張紅偉等[21]取膠囊內(nèi)容物1.0 g,用70%乙醇加熱回流,過(guò)濾后將沉淀洗滌2次,合并上清液,通過(guò)AB-8型大孔徑樹脂柱分離純化,用水和70%乙醇梯度洗脫,洗脫液濃縮成干膏,再用甲醇溶解定容至100 mL,最后以0.20 μm濾膜過(guò)濾得供試液.
雙黃連凝膠劑型樣品需用適宜溶劑超聲溶解,再經(jīng)過(guò)濾后備用.如陳兩綿等[22]取雙黃連凝膠劑約0.7 g,置于50 mL容量瓶中,加適量50%甲醇,超聲使其溶解,放置室溫后,用50%甲醇定容至刻度,搖勻后0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),取濾液作為供試品溶液;趙永慧等[23]同樣選取雙黃連凝膠為樣品,處理步驟與上述類似,不同的是溶劑使用乙腈/水(體積比為27∶73)進(jìn)行溶解,得到待測(cè)樣品.
色譜指紋圖譜分析雙黃連的方法主要有液相色譜(liquid chromatography,LC)及其聯(lián)用、薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)、氣相色譜(gas chromatography,GC)和毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)等方法.
常用LC及聯(lián)用方法主要包括高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)、高效液相色譜-二極管陣列聯(lián)用技術(shù)(HPLC-photo-diode array,HPLC-PDA)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-mass spectrometry,HPLC-MS)、高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-electrospray ionization-MS,HPLC-ESI-MS)、超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)和超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS)等.
2.1.1 HPLC及其聯(lián)用方法
HPLC因具有高壓、高效和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制檢測(cè)[24-25].其原理是依據(jù)各組分在流動(dòng)相中的吸附性能和分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離,并進(jìn)入檢測(cè)器檢驗(yàn),實(shí)現(xiàn)試樣分析.至今,許多學(xué)者已采用該技術(shù),對(duì)多種劑型的雙黃連進(jìn)行檢測(cè)分析,為雙黃連的質(zhì)量控制帶來(lái)了新的可能.以下圍繞HPLC、HPLC-MS及HPLC-ESI-MS等方法在雙黃連色譜指紋圖譜分析中的研究情況展開綜述.
陳?。?0]采用HPLC對(duì)10批雙黃連口服液的藥用成分進(jìn)行了檢驗(yàn),在100.0 g雙黃連產(chǎn)品中分析黃芩、連翹和金銀花,3種主成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%、50%和25%,其中連翹的占比最大,且連翹苷和連翹脂苷在相應(yīng)的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,研究得出不同批次的雙黃連口服液品質(zhì)差異較小;馮宏玲等[11]采用HPLC建立了雙黃連口服液化學(xué)成分的指紋圖譜,設(shè)置柱溫為30℃,流動(dòng)相為甲醇/冰乙酸,流速為1.0 mL/min,梯度洗脫,同時(shí)分離黃芩苷、連翹苷和綠原酸,其分析速率較藥典法明顯提高,以此提供了簡(jiǎn)便易行的雙黃連多組分同時(shí)分離新方法;郭潔等[13]建立雙黃連凍干粉指紋圖譜并進(jìn)行研究,以流動(dòng)相乙腈/甲酸梯度洗脫,設(shè)置流速為1.0 mL/min、柱溫為25℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm、洗脫時(shí)間為25 min時(shí),結(jié)果檢測(cè)到21個(gè)色譜峰,并對(duì)7個(gè)色譜峰進(jìn)行了歸屬,較為全面地反映了雙黃連凍干粉所含的化學(xué)成分,有利于對(duì)其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià);武煊[26]對(duì)10批獸用雙黃連注射液HPLC指紋圖譜進(jìn)行了研究,流動(dòng)相采用乙腈/乙酸,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,檢測(cè)到16個(gè)共有峰,并對(duì)黃芩苷、連翹苷和綠原酸的含量進(jìn)行了測(cè)定,該實(shí)驗(yàn)為后期中獸藥的品質(zhì)研究提供了很大的幫助;周志等[18]建立雙黃連顆粒HPLC指紋圖譜并進(jìn)行探究(圖1),流動(dòng)相為乙腈/甲酸/水溶液,流速為1.0 mL/min,柱溫為35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,檢測(cè)出12批顆粒的圖譜相似度≥0.998,得到共有色譜峰18個(gè),確定了7個(gè)特征峰譜的歸屬,該方法穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好,為雙黃連顆粒質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了依據(jù).
圖1 雙黃連顆粒與各單味藥的高效液相色譜(HPLC)[18]
PDA目前已廣泛應(yīng)用于HPLC分析中,應(yīng)用其作為檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行全波長(zhǎng)測(cè)定,并可在多通道模式進(jìn)行分析,同時(shí)給出紫外吸收光譜和色譜圖,便于組分定性和定量分析.王新宏等[12]對(duì)不同廠家的雙黃連口服液和同一廠家的不同批號(hào)雙黃連片劑的數(shù)字化色譜指紋圖譜進(jìn)行研究,以乙腈/乙酸/水溶液作流動(dòng)相梯度洗脫,流速1.0 mL/min,柱溫為室溫,采用PDA檢測(cè)器,在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm時(shí),鑒定了金銀花、連翹和黃芩3種藥材,且不同批號(hào)的圖譜顯示,每一批號(hào)片劑總色譜峰為28個(gè),3個(gè)以上批號(hào)都出現(xiàn)的峰為23個(gè),其色譜峰個(gè)數(shù)重疊率>82%,該實(shí)驗(yàn)采用1次進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定,證實(shí)HPLC-PDA檢測(cè)方法既簡(jiǎn)便又穩(wěn)定,為雙黃連制劑和中藥材的測(cè)定提供可行的新方法.
HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)適用于極性強(qiáng)、揮發(fā)度低、相對(duì)分子質(zhì)量大及熱不穩(wěn)定的混合有機(jī)物體系,更利于復(fù)雜物質(zhì)的分離與檢測(cè).Han等[27]利用HPLCMS結(jié)合RBL-2H3/CMC柱層析,建立雙黃連注射液中潛在過(guò)敏成分的二維分析體系,在保證具有良好重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上分析出雙黃連潛在過(guò)敏成分——黃芩苷,該方法成功地實(shí)現(xiàn)了雙黃連注射液中潛在過(guò)敏成分黃芩苷的篩選.
ESI是一種產(chǎn)生氣相離子的軟電離技術(shù),可同時(shí)提供精確的相對(duì)分子質(zhì)量和碎片結(jié)構(gòu)信息,且可與各種色譜聯(lián)用,特別適合于復(fù)雜樣品分析.Zhang等[15]采用HPLC-ESI-MS建立雙黃連注射液的色譜指紋圖譜(圖2),研究分析得出黃芩苷和蘆丁都會(huì)促進(jìn)組胺的釋放進(jìn)而引起過(guò)敏反應(yīng),此結(jié)果科學(xué)有效地揭示了雙黃連注射液的過(guò)敏原因;羅奇志和羅佳波[28]利用HPLC-ESI-MS得到雙黃連粉針劑的總離子流圖,分析了雙黃連粉針中的化學(xué)成分,采用全離子模式進(jìn)行掃描,流動(dòng)相為乙腈/水溶液,結(jié)果確定了18種化合物的相對(duì)分子質(zhì)量,鑒定出9種化合物,除檢測(cè)到已有報(bào)道的黃芩苷、連翹苷、綠原酸和咖啡酸等,還分析到未曾報(bào)道的奎尼酸(來(lái)自金銀花);Luo等[29]利用HPLC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù),在總離子流圖中檢測(cè)到43個(gè)色譜峰(圖3),并對(duì)雙黃連粉針劑中的各個(gè)成分進(jìn)行了歸屬,其中21個(gè)峰來(lái)自金銀花,20個(gè)峰來(lái)自連翹,4個(gè)峰來(lái)自黃芩(金銀花和連翹有共有峰);王有志等[30]利用HPLC-ESI-MS首先得出奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的MS圖和離子掃描圖(圖4),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得雙黃連粉針劑供試液中奎寧酸的含量,為紫外吸收能力弱的奎尼酸的含量測(cè)定找到了可行的辦法.
圖2 不同批次雙黃連注射液的HPLC指紋圖譜[15]
注:數(shù)字為峰編號(hào).圖3 不同性狀雙黃連的離子掃描[29](a)雙黃連粉針供試液;(b)自制雙黃連粉針提取物;(c)金銀花與連翹合煎提取物;(d)金銀花提取物;(e)連翹提取物;(f)黃芩提取物
圖4 奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)圖譜[30]
2.1.2 UPLC及其聯(lián)用方法
UPLC與HPLC的原理基本相同,但前者的分析速度更快,與MS聯(lián)用后表現(xiàn)出更加優(yōu)異的性能.石朗等[31]在對(duì)雙黃連制劑進(jìn)行UPLC-MS指紋圖譜分析的同時(shí),建立了雙黃連中間體指紋圖譜,在雙黃連制劑和中間體圖譜中都找到了指認(rèn)的3個(gè)共有峰,表明其相關(guān)性良好,為雙黃連高效、全面的質(zhì)量控制提供了參考.
UPLC-MS同樣可選用ESI作為電離源,提高分析的靈敏度和選擇性.劉雪紅等[32]建立雙黃連口服液UPLC-MS指紋圖譜,同時(shí)測(cè)定黃芩苷、連翹苷和綠原酸的含量,以甲酸/水/乙腈為流動(dòng)相,在ESI負(fù)離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行檢測(cè),相較之前HPLC或HPLC-MS技術(shù),該方法可同時(shí)測(cè)定3種有效成分的含量,結(jié)果更快速、更高效、更準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好;張紅偉等[21]同樣采用 UPLC-ESI-MS方法,對(duì)以上3種有效成分同時(shí)測(cè)定,以醋酸鈉/甲醇為流動(dòng)相,在ESI正離子模式下進(jìn)行檢測(cè),得出第1、2和3批雙黃連膠囊提取液樣品中綠原酸、黃芩苷和連翹苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為 15.32、149.00和 4.05,16.05、158.00和 4.11,15.89、143.00 和4.14 mg/g,為雙黃連膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法;Yan等[33]利用UPLC-ESI-MS方法,在正離子和負(fù)離子2種ESI模式下對(duì)雙黃連的成分進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果得到46個(gè)峰并對(duì)其進(jìn)行了歸屬,結(jié)合背景減法為研究雙黃連的代謝產(chǎn)物提供了依據(jù),有助于檢測(cè)雙黃連的活性成分.
TLC是將適宜的固定相(如硅膠、氧化鋁等)涂布在玻璃板或塑料等基片上,制成均勻薄層.待點(diǎn)樣后并選用合適的展開劑進(jìn)行展開后,與對(duì)照物的比移值進(jìn)行對(duì)比分析的一種分離檢測(cè)技術(shù).該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn).
肖宏華等[34]利用TLC對(duì)雙黃連口服液中的金銀花進(jìn)行鑒別,以乙酸乙酯/丙酮/甲酸/水(體積比為7∶3∶1∶1)作為展開劑,分別采用金銀花中的木犀草苷和綠原酸,山銀花中的灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙作為特征成分,通過(guò)比較圖譜中熒光條斑的有無(wú)和深淺,成功鑒別金銀花中是否摻入山銀花;程建國(guó)等[35]曾對(duì)《中華人民共和國(guó)獸藥典2000年版》[36]和《中華人民共和國(guó)獸藥典 2005年版》[37]收載的2種雙黃連口服液成分的TLC方法進(jìn)行了比較,結(jié)果前者的斑點(diǎn)更清晰,分離得更好,后者沒(méi)有顯示任何斑點(diǎn),所以其推薦使用2000年版.李宇偉和連瑞麗[38]在用正交試驗(yàn)法優(yōu)選雙黃連口服液時(shí),采用TLC對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確證,分別對(duì)處方中的金銀花、黃芩和連翹進(jìn)行鑒別,TLC中供試品與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上呈相同顏色的熒光斑點(diǎn)(圖5),而陰性對(duì)照則無(wú)此斑點(diǎn).該方法操作簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性好,結(jié)果可靠,利于雙黃連口服液及其中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制.
注:數(shù)字指不同樣品點(diǎn).圖5 雙黃連中3種中藥材的TLC指紋圖譜[38](a)金銀花;(b)黃芩;(c)連翹
GC法適用于有揮發(fā)性且不易分解的化合物的分離和分析,該方法具有分離效率高、速度快、樣品量少、靈敏度高和選擇性高等優(yōu)點(diǎn).
茹鑫等[39]建立GC指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)譜對(duì)照?qǐng)D(圖6),對(duì)雙黃連口服液中的可揮發(fā)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和分析,結(jié)果共檢測(cè)出96種揮發(fā)性物質(zhì),并歸屬了43種化合物,為雙黃連的質(zhì)量控制提供了有力依據(jù);王栗等[40]利用GC法對(duì)雙黃連粉針劑中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果檢測(cè)到連翹、黃芩和金銀花中均含微量的有機(jī)氯農(nóng)藥,但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于我國(guó)對(duì)糧食中農(nóng)藥殘留規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),該方法利于雙黃連的用藥安全性檢測(cè).
注:S1~S10是10批相同濃度的雙黃連注射液編號(hào);R是參比色譜.圖6 雙黃連注射液的檢測(cè)圖譜[39](a)氣相色譜指紋圖譜;(b)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜
CE技術(shù)是依據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為的差異來(lái)進(jìn)行分離,主要用來(lái)分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì).CE具有多種模式,如毛細(xì)管電泳色譜法(capillary electrochromatography,CEC)和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC)等,該方法既能分離離子又能分離中性分子.
CEC是CE與HPLC相結(jié)合的一種快速、高效的分離方法,利用緩沖溶液的電滲流作為泵,具有操作簡(jiǎn)單、成本低和毛細(xì)管柱壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn),但是靈敏度稍遜于高效液相色譜.孫國(guó)祥等[41]建立了雙黃連膠囊雙波長(zhǎng)CEC指紋圖譜,以50 mmol/L硼砂(含20 mmol/L β環(huán)糊精和5%乙腈,溶液pH 7.55)為背景電解質(zhì),電壓為12 kV,檢測(cè)波長(zhǎng)為203和256 nm,分別檢測(cè)出16和11個(gè)共有指紋峰,為雙黃連的質(zhì)量控制提供了新依據(jù);呂元琦等[42]建立CEC圖(圖7),分離并檢測(cè)到以上3種成分,還測(cè)得了黃芩甙元的含量;Luan等[43]通過(guò)建立高效CEC方法,對(duì)雙黃連中的重金屬(Cd2+、Cr3+、Cu2+和 Zn2+)進(jìn)行了有效測(cè)定,為雙黃連中重金屬離子的安全性進(jìn)行把控.
圖7 雙黃連口服液毛細(xì)管電泳色譜[42]
MEKC是毛細(xì)管區(qū)帶電泳與膠束液相色譜相結(jié)合而發(fā)展的方法,具有分離速度快、分離效率高和毛細(xì)管柱不易被污染等優(yōu)點(diǎn).Zhou等[44]采用MEKC對(duì)雙黃連進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià),以硼酸鹽/二氫磷酸鈉/十二烷基硫酸鈉為緩沖液,甲醇和乙腈為有機(jī)改性劑,電壓為15 kV.對(duì)雙黃連中黃芩素、黃芩苷、綠原酸、漢黃芩素、黃芩素、連翹苷和金絲桃苷等7種主要成分進(jìn)行定量測(cè)定,為提高雙黃連制劑的整體分析和質(zhì)量控制提供依據(jù).
譜效關(guān)系的研究是數(shù)學(xué)相關(guān)分析與藥學(xué)的一個(gè)交叉應(yīng)用,因此,一方面需要鑒定色譜指紋圖譜中的主要化學(xué)成分,在此基礎(chǔ)上通過(guò)譜效學(xué)研究揭示特征色譜峰;另一方面運(yùn)用合理的數(shù)據(jù)處理分析方法,主要包括相關(guān)分析、回歸分析、主成分分析、典型相關(guān)分析、聚類分析和灰度關(guān)聯(lián)度分析等,實(shí)現(xiàn)數(shù)學(xué)相關(guān)分析與色譜指紋圖譜的關(guān)聯(lián).目前,雙黃連的譜效關(guān)系研究仍處于初步探索階段,已形成一定的研究思路和模式.劉廷等[45]首次把HPLC色譜指紋圖譜與雙黃連對(duì)H1N1流感病毒致犬腎(Madin-Darby canine kidney,MDCK)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用聯(lián)系起來(lái),通過(guò)HPLC數(shù)據(jù)和藥效數(shù)據(jù)的SPSS分析,得出17個(gè)特征色譜共有峰,其中與該保護(hù)作用關(guān)系較大的峰有5個(gè)(3個(gè)峰對(duì)應(yīng)金銀花,2個(gè)峰對(duì)應(yīng)連翹),得出雙黃連中可以保護(hù)H1N1流感病毒致MDCK細(xì)胞損傷的成分為雙黃連和連翹,該實(shí)驗(yàn)將雙黃連的療效與圖譜結(jié)合,有效地分析出發(fā)揮藥理作用的化學(xué)成分,為后期雙黃連療效與圖譜的結(jié)合提供思路,并奠定了雙黃連譜效學(xué)研究的基礎(chǔ);王建明和趙楚文[46]利用HPLC法測(cè)定雙黃連中連翹苷的含量,再以大鼠為研究對(duì)象并設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、模型組和對(duì)照組,采用不同方式處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果證實(shí),先給予雙黃連的大鼠在體溫升高后有明顯的下降趨勢(shì),驗(yàn)證了雙黃連中的連翹苷成分有退熱的效果,即該方法成功地探索出雙黃連中與H1N1流感病毒致MDCK細(xì)胞損傷作用和退熱作用相對(duì)應(yīng)的有效成分.
雙黃連作為一種中成藥,其化學(xué)成分的構(gòu)成并不能代表在體內(nèi)產(chǎn)生生物效應(yīng)的化學(xué)形式,色譜指紋圖譜與譜效學(xué)的研究可以有效地闡釋藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué),有利于雙黃連品質(zhì)的控制與評(píng)價(jià).雙黃連是一個(gè)多組分、多靶點(diǎn)和多作用途徑的復(fù)雜體系,用精確的處理方法處理模糊的中藥成分和藥效關(guān)系尚且存在一定的局限性,色譜指紋圖譜技術(shù)目前只能部分解決對(duì)共有峰成分的鑒定,體現(xiàn)某個(gè)組分與藥效的相關(guān)性,而每個(gè)成分及成分之間的相互作用或協(xié)同作用沒(méi)有闡述清楚,導(dǎo)致成分與功效只能達(dá)到部分相關(guān),而未能實(shí)現(xiàn)完全相關(guān).
2020年1月31日,中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所和武漢病毒研究所開展的聯(lián)合研究表明,雙黃連口服液可抑制新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[47],目前為止,該結(jié)果尚未納入COVID-19的診治方案中,其療效有待于進(jìn)一步的思考與研究.因此,進(jìn)行雙黃連的譜效學(xué)的研究是大有裨益的.目前,有關(guān)中藥譜效學(xué)理論的研究方向及方法主要包括[48-51]:通過(guò)藥物信息學(xué)方法尋找藥效成分,建立多組分藥效預(yù)測(cè)模型,對(duì)藥效組分配伍進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),構(gòu)建藥效作用的多因素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)模型,探索多種藥效組分協(xié)同作用機(jī)制;建立與動(dòng)物(人)“證”模型相對(duì)應(yīng)的狀態(tài)函數(shù)關(guān)系式的現(xiàn)代中醫(yī)藥數(shù)理表述體系,根據(jù)特性蛋白質(zhì)與效應(yīng)體(藥物)的齒合關(guān)系,按親和色譜,以效應(yīng)體靶向分離物——特性蛋白質(zhì)為固定相,采用LC聯(lián)用技術(shù),建立品質(zhì)或效應(yīng)指紋圖譜.因此,接下來(lái)的研究需要一方面建立雙黃連多組分藥效預(yù)測(cè)模型,對(duì)藥效進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),探索多種藥效組分協(xié)同作用機(jī)制;另一方面建立動(dòng)物(人)“證”模型相對(duì)應(yīng)的狀態(tài)函數(shù)關(guān)系式,根據(jù)特性蛋白質(zhì)與雙黃連藥效成分的齒合關(guān)系,采用LC聯(lián)用技術(shù)建立質(zhì)量或效應(yīng)指紋圖譜.
在現(xiàn)有的探索研究中,面臨的難題主要包括:建立高重復(fù)性和高精度的適用于進(jìn)行生物測(cè)定的方法難度高,這與生物個(gè)體的復(fù)雜性和待分析樣品的復(fù)雜性有關(guān);將指紋圖譜所獲取的化學(xué)成分特征信息與生物效應(yīng)相關(guān)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)具有一定的困難;化合物對(duì)照品數(shù)量有限,部分樣品價(jià)格昂貴;部分檢驗(yàn)部門的硬件設(shè)施不夠,難以滿足實(shí)驗(yàn)要求.
不同劑型雙黃連樣品的前處理方法中,通常以甲醇/水進(jìn)行溶解,也可選用乙腈/水體系,且多借助超聲助溶,其中片劑和顆粒劑因其粒徑相對(duì)較大,需研磨后再進(jìn)行溶解,在色譜分析前多采用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾.色譜指紋圖譜作為中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)在雙黃連品質(zhì)評(píng)價(jià)中有著舉足輕重的地位,色譜相關(guān)的方法(LC、TLC、GC和CE)可以有效地對(duì)雙黃連中間體及其成品進(jìn)行成分鑒定和品質(zhì)檢測(cè),可用于生產(chǎn)工藝與流程的監(jiān)管.目前有關(guān)雙黃連譜效關(guān)系的研究遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需求.因此,仍需依據(jù)不同研究目的建立雙黃連色譜指紋圖譜與相應(yīng)藥效的關(guān)聯(lián),進(jìn)一步探索其應(yīng)用.
當(dāng)前,中藥色譜指紋圖譜與譜效關(guān)系的研究逐漸增多,主要包括對(duì)中藥的品質(zhì)評(píng)價(jià),提取與純化,炒炭前后的作用等,但是由于譜效學(xué)的發(fā)展時(shí)間短暫,目前理論體系不夠完善,技術(shù)尚有不足,從研究成分到藥效再到臨床應(yīng)用之間尚有一定距離,未來(lái)仍需不斷地發(fā)展與完善,為實(shí)現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化而努力.