高效液相色譜法測(cè)定四季青中長(zhǎng)梗冬青苷

蔣婷婷，鄭金星，林雪志

（浙江福立分析儀器股份有限公司，浙江臺(tái)州 317500）

四季青是一種中藥材，為冬青屬植物冬青的干燥葉，廣泛分布于長(zhǎng)江以南的各省，葉片呈橢圓形或披針形，具有清熱解毒、涼血止血、收斂生肌等功效［1–4］，臨床上用于急性支氣管炎、肺炎、急性咽喉炎、膽道感染、尿路感染、痢疾、燒傷、下肢潰瘍、皮炎等疾病治療［5–6］?，F(xiàn)代研究證實(shí)，四季青也可以改善心血系統(tǒng)功能，可用于冠心病、心絞痛以及病毒性角膜炎等疾?。?］。

從四季青中可分離出原兒茶酸、咖啡酸、丁香苷、龍膽酸、異香草酸、長(zhǎng)梗冬青苷等［8］，長(zhǎng)梗冬青苷是四季青的主要有效成分，又名具棲冬青苷，屬于五環(huán)三萜類化合物。目前研究證明長(zhǎng)梗冬青苷具有抗炎、抗心律失常、心肌缺血和腦缺血作用［9］。在2020 年《中國藥典》中明確要求四季青中長(zhǎng)梗冬青苷的含量不得少于1.35%［10］。畢福鈞等［11–14］采用高效液相色譜–紫外檢測(cè)器（HPLC–UV）法測(cè)定長(zhǎng)梗冬青苷，使用210 nm 及更低的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相易干擾，紫外檢測(cè)器噪音大，靈敏度低。魏秀麗等［15］采用超高效液相色譜–二極管陣列檢測(cè)器（UPLC–PAD）法對(duì)長(zhǎng)梗冬青苷進(jìn)行測(cè)定，雖然能夠快速的定量測(cè)定，但靈敏度低，且UPLC 設(shè)備昂貴，該方法不具有普適性。Waiou Zhao 等［16］采用液相二級(jí)質(zhì)譜（LC／MS／MS）法測(cè)定，雖然靈敏度高，但設(shè)備昂貴，現(xiàn)階段無法全面推廣。高效液相色譜儀價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，同時(shí)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）不受流動(dòng)相影響，可檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品，檢測(cè)靈敏度高。目前國內(nèi)外未見采用高效液相色譜–蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC–ELSD）法測(cè)定四季青中長(zhǎng)梗冬青苷含量的方法。

筆者通過信噪比確定了檢測(cè)器的最佳檢測(cè)條件，構(gòu)建的HPLC–ELSD 方法使用成本低，簡(jiǎn)單易實(shí)施，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，可用于中藥材四季青中長(zhǎng)梗冬青苷的含量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC5090 型，浙江福立分析儀器股份有限公司。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：UM5800 型，上海通微分析技術(shù)有限公司。

電子天平：SQP 型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ5200 型，昆山市超聲儀器有限公司。

破壁機(jī)：MJ–BL1543A 型，美的集團(tuán)。

一次性注射器：5 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

過濾膜：0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

甲醇、異丙醇：均為色譜純，美國天地公司。氮?dú)猓杭兌炔恍∮?9.2%，浙江海暢氣體有限公司。長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：批號(hào)為8547，含量99.9%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱量長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.003 2 g 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇–水（8∶2）溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.32 mg／mL 的長(zhǎng)根冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

水：飲用純凈水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Sapphiresil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，浙江福立分析儀器股份有限公司）；柱溫：30 ℃；ELSD 漂移管溫度：50 ℃；氣體流量：2.5 L／min；流動(dòng)相：A 相為甲醇–異丙醇（9∶1）溶液，B 相為水–異丙醇（9∶1）溶液，流量為1.0 mL／min，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度淋洗程序

1.3 樣品處理

將四季青葉放入破壁機(jī)中粉碎3 min，精確稱取粉末1.000 0 g于具塞錐形瓶中，加入50 mL 甲醇–水（8∶2）溶液，稱重并記錄重量，超聲30 min，放冷后再次稱重，用甲醇–水（8∶2）溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，用一次性注射器吸取溶液，再用0.22 μm 的過濾膜過濾，制備成樣品溶液，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 漂移管溫度選擇

在氣體流量為2.5 L／min 的條件下，分別設(shè)置ELSD 漂移管進(jìn)樣溫度分別為40、50、55、60、65 ℃，分別考察不同漂移管溫度對(duì)信噪比的影響，測(cè)定結(jié)果列于表2。由表2 可以看出，隨著漂移管溫度的升高，色譜峰高與噪音均呈先降低后升高的趨勢(shì)，而信噪比呈先升高后降低趨勢(shì)，綜合考慮，選擇漂移管溫度為50 ℃。

表2 不同漂移管溫度的測(cè)定結(jié)果

2.2 氣體流量選擇

設(shè)定ELSD 漂移管溫度為50 ℃，分別選擇氣體流量為2.0、2.5、3.0 L／min，分別考察不同氣體流量對(duì)信噪比的影響，測(cè)定結(jié)果列于表3。由表3 可以看出，當(dāng)氣體流量為2.5 L／min 時(shí)色譜峰高于最大值，噪音最小且信噪比最優(yōu)，因此選擇氣體流量為2.5 L／min。

表3 不同氣體流量的測(cè)定結(jié)果

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取10 μL 長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在1.2 條件下進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液中長(zhǎng)梗冬青苷的柱效是39 518，樣品溶液中長(zhǎng)梗冬青苷的柱效是37 842，均滿足2020 年中國藥典要求柱效不低于2 000 的要求。長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖分別如圖1、圖2 所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系、檢出限、定量限

取0.32 mg／mL 長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣5、10、20、50 μL，按1.2 儀器工作條件測(cè)定，以長(zhǎng)梗冬青苷進(jìn)樣質(zhì)量的對(duì)數(shù)（x）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)色譜峰面積的對(duì)數(shù)（y）為縱坐標(biāo)，建立線性方程。結(jié)果表明長(zhǎng)根冬青苷進(jìn)樣質(zhì)量在0.16～16 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.65x+2.5，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

分別配制一定濃度的長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2 儀器工作條件進(jìn)樣10 μL，使其分別滿足信噪比為3∶1、10∶1 的要求，計(jì)算檢出限和定量限。得到方法檢出限為0.016 mg／mL，定量限為0.048 mg／mL，滿足分析要求。

2.5 儀器精密度試驗(yàn)

取0.32 mg／mL 長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，保留時(shí)間和色譜峰面積的測(cè)定結(jié)果列于表4、表5。由表4、表5 可知，保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.140%，色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.864%，均不大于2%，表明儀器具有較好的精密度，符合藥典規(guī)定。

表4 儀器精密度測(cè)定結(jié)果（保留時(shí)間計(jì)）

表5 儀器精密度測(cè)定結(jié)果（色譜峰面積計(jì)）

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別精密稱取6 份同一批已測(cè)定長(zhǎng)梗冬青苷含量（800 μg／mL）的樣品1.00 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入16、48、320 μg／mL 長(zhǎng)梗冬青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2 儀器工作條件測(cè)定，結(jié)果列于表6。由表6可知，長(zhǎng)梗冬青苷的加標(biāo)回收率為96.25%～98.89%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%～3.56%，表明本法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。

表6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測(cè)定

分別精密稱取5 批四季青葉，按1.3 配制樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，按1.2 儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表7。由表7 可知，5 批四季青葉中長(zhǎng)梗冬青苷檢出含量為3.73%～4.97%，滿足2020 年中國藥典使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定長(zhǎng)梗冬青苷含量不少于1.35%的要求。

表7 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語

建立HPLC–ELSD 法測(cè)定長(zhǎng)梗冬青苷含量，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，滿足藥典要求，可用于四季青中長(zhǎng)梗冬青苷的含量測(cè)定，為中藥材四季青的質(zhì)量監(jiān)控提供方法參考。