代謝組學(xué)技術(shù)在中藥質(zhì)量控制和毒性評價中的應(yīng)用

鄭州市第一人民醫(yī)院（450000）王青 王帥

隨著現(xiàn)代中醫(yī)的完善與推廣，尤其是新型冠狀病毒感染肺炎傳播期間中醫(yī)、中藥因其不可忽視的療效在全球引起關(guān)注，但是就中藥而言，其成分復(fù)雜、作用靶點較多，藥物質(zhì)量分析及控制難度加大，同時長期口服某一種中藥不可避免地產(chǎn)生機體毒性[1]，因此中藥質(zhì)量的評價、控制及毒性研究一直是中藥研究重點，有效的評估方式是安全用藥及中藥、中成藥良性發(fā)展的保證?；蚣夹g(shù)快速發(fā)展后人類進入后基因時代，研究熱點逐漸轉(zhuǎn)向“組學(xué)”研究，代謝組學(xué)已經(jīng)成為一門學(xué)科[2]，通過各種定量、定性方法檢測生物體系中的低分子量代謝產(chǎn)物，分析產(chǎn)物與被研究對象之間的生理、病理、環(huán)境因素、基因組成等關(guān)聯(lián)，為藥物作用機理、活性成分分析、療效評估、質(zhì)量控制及毒副作用評價等提供數(shù)據(jù)支持。本文以連花清瘟膠囊復(fù)方制劑為案例，旨在探討代謝組學(xué)技術(shù)在中藥化學(xué)成分質(zhì)量控制及毒性評價中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 準(zhǔn)備40份不同批次的連花清瘟膠囊為觀察組，保證藥物的批次不同、藥物均處于有效期內(nèi)、既往保存方式適宜；另準(zhǔn)備與觀察組相同數(shù)量、相同批次的40份連花清瘟膠囊為對照組，將膠囊內(nèi)容物人為依次放置于60℃高溫環(huán)境、相對濕度95%高濕環(huán)境、4500lx陽光直射環(huán)境下，累計放置天數(shù)為20d。

1.2 方法 主要儀器包括Waters公司生產(chǎn)的超高效液相色譜儀、GC system（型號：7890A，Agilent公司提供），依據(jù)說明書完成操作，取連花清瘟膠囊的內(nèi)容物，研磨成細(xì)粉，精確稱重后加入乙醇，經(jīng)過后續(xù)處理獲得溶液，將溶液注入超高效液相色譜儀完成UPLC檢測，獲得色譜圖。GC檢測中，按步驟獲取三氯甲烷溶解過的濾液，利用GC儀獲取色譜圖。檢測人員均有豐富的操作經(jīng)驗，檢測儀器經(jīng)過調(diào)試，檢測過程嚴(yán)格遵守程序規(guī)范。

1.3 觀察指標(biāo) 用UPLC技術(shù)、GC技術(shù)進行兩組藥物化學(xué)成分的分析，前者檢測指標(biāo)包括綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、連翹苷、蘆丁、異綠原酸C及咖啡酸，后者指標(biāo)為薄荷腦及百秋李醇。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)均錄入SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，各化學(xué)成分指標(biāo)、揮發(fā)性成分指標(biāo)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 UPLC技術(shù)分析的化學(xué)成分結(jié)果比較兩組藥物中的連翹苷含量比較基本相當(dāng)，無顯著差異（P＞0.05）；其余指標(biāo)如咖啡酸、蘆丁、綠原酸等觀察組含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

2.2 兩組GC技術(shù)下的揮發(fā)性成分分析比較 觀察組薄荷腦含量為（20.76±1.54）mg/g高于對照組的（17.56±1.75）mg/g（P＜0.05），但觀察組與對照組百秋李醇含量比較，（0.22±0.10）mg/gVS（0.18±0.09）mg/g，無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

中藥本質(zhì)屬于植物，植物在維持生命活動過程中的初生代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物達(dá)20萬種以上[3]，其中部分產(chǎn)物即為中藥的治療活性成分，而同一種中藥活性成分的種類、數(shù)量、含量受該植物的品種、收取季節(jié)、生長環(huán)境、炮制方式等因素影響，因而形成質(zhì)量上的差異及毒性上的不可控風(fēng)險，換言之，導(dǎo)致中藥質(zhì)量問題的關(guān)鍵在于植物代謝組的變化[4]，因此代謝組學(xué)技術(shù)通過對多種化學(xué)成分組成的混合物中各組分含量、狀態(tài)、類型進行區(qū)分、分析，予以定量評價，進而對藥物予以質(zhì)量水平的評價。GC法、HPLC法均是當(dāng)前較為常用的代謝組學(xué)技術(shù)，HPLC能進行中藥活性成分的分離及定量，GC應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)、揮發(fā)油含量的測定[5]，上述兩種單分析技術(shù)能較好地完成化學(xué)成分定量定性檢測，對藥物毒理作用、藥理作用均能明確，有研究稱[6]，經(jīng)代謝組學(xué)技術(shù)檢測的中藥有效成分定量檢測結(jié)果可作為藥品質(zhì)量評價的指標(biāo)。

附表 兩組UPLC技術(shù)下的化學(xué)成分分析比較(n=40,mg/g)

中藥復(fù)方制劑相較于普通中藥而言，其組成成分、毒性作用更加復(fù)雜，質(zhì)量控制、毒性評價難度更大[7]，因此筆者選擇了復(fù)方制劑作為代謝組學(xué)的研究實施對象，以連花清瘟膠囊為例，觀察組40份不同批次正常藥物與同等數(shù)量對照組刻意損害藥物中連翹苷含量相差不大，《中國藥典》中規(guī)定[8]：連花清瘟膠囊中連翹苷≥0.17mg/粒，本品換算結(jié)果為≥0.49mg/g，故兩組藥物均符合要求，但觀察組綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C、連翹酯苷A等成分明顯高于對照組，表明即使對照組藥物仍然有效但其部分有效成分已經(jīng)發(fā)生了變異，在原有標(biāo)明的毒副作用基礎(chǔ)上出現(xiàn)變異風(fēng)險的概率增大。利用GC測定的揮發(fā)性物質(zhì)含量結(jié)果顯示，刻意破壞的連花清瘟膠囊中薄荷腦、百秋李醇含量均較觀察組降低，且依據(jù)藥物說明書內(nèi)容概括：薄荷腦21.42mg/g、百秋李醇0.243mg/g，觀察組與之基本一致，而對照組則明顯低于理論值，提示不合理保存條件（如高溫、陽光直射、濕度過高等）下的藥物發(fā)生質(zhì)量問題的風(fēng)險是不可忽視的。陸春美等[9]學(xué)者亦認(rèn)為代謝組學(xué)技術(shù)不僅可以研究藥物自身的代謝變化，還可分析藥物造成的內(nèi)源性代謝物水平的改變，能直接反映體內(nèi)各成分的生物化學(xué)過程及狀態(tài)的變化，代謝組學(xué)技術(shù)能對中藥種屬、產(chǎn)地、生長年限、采收期、藥物部位、生長模式、貯存、炮制等方面的質(zhì)量差異進行識別，同時對代謝物變化過程中產(chǎn)生的毒性損傷進行測定[10]，如針對蛇床子、白附片等藥物采用HPLC與質(zhì)譜法（Mass Spectrometry，MS）或核磁共振交叉聯(lián)合檢測技術(shù)，可進行有毒代謝產(chǎn)物的生物學(xué)標(biāo)志識別，對毒性代謝產(chǎn)物進行預(yù)見性分析、評估藥物的安全性。

綜上所述，代謝組學(xué)技術(shù)在中藥質(zhì)量定量評估及毒性評價中有極其重要的意義，但因具體藥物的復(fù)雜性及相關(guān)操作的難度等原因，存在不可忽視的局限性，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)限制因素逐漸得到化解，如盡力組建“全能型”的分析技術(shù)，減少非實驗性的干擾因素，逐漸完善代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫及各具體代謝物的標(biāo)準(zhǔn)值范圍等。就本研究而言，未針對不同批次連花清瘟膠囊進行單個藥物分析是本研究不足之處，以平均方式分析增加了個體性遺漏的風(fēng)險。