兔源奇異變形桿菌的分離鑒定及耐藥基因檢測

廖娟　石英子　馮丹妮　王鋼　喻世剛　楊子藝　梁梓

摘要：對腹瀉死亡的兔腸道中分離得到的1株疑似病原菌進行鑒定及其耐藥基因檢測，并對分離菌進行了革蘭氏染色、生化鑒定、16SrRNA基因序列分析，確定分離菌株為奇異變形桿菌，將其命名為T2019。將分離菌株與NCBI中10株已登錄的標準菌株進行同源性比對，并用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，證明T2019與多種不同來源的奇異變形桿菌親源性較近。藥敏試驗結(jié)果以及PCR體外擴增技術(shù)對相關(guān)耐藥基因表型檢測結(jié)果表明，T2019除對米諾環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)為敏感，對四環(huán)素和多西四環(huán)素表現(xiàn)為中介以外，對其他所試抗生素均表現(xiàn)為耐藥。檢出耐藥基因tetB、ant（3″）-I、strA和sul2，其他所試耐藥基因未檢出。這為奇異變形桿菌引起兔疾病診斷及合理使用常規(guī)抗生素藥物提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：兔;奇異變形桿菌;分離;鑒定;耐藥基因

中圖分類號：S852.61文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0125-05

作者簡介：廖娟（1990—），女，四川樂山人，碩士，實驗師，主要從事家禽腸道微生物研究。E-mail：lsliaojuan@163.com。

通信作者：王鋼，碩士，教授，主要從事養(yǎng)殖業(yè)廢棄物處理與資源化利用研究。E-mail：1274898363@qq.com。

奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）是一種無莢膜、無芽孢，性狀多為短桿菌的革蘭氏陰性菌，是一種常見的人畜共患病原菌[1-2]。該菌廣泛地分布于自然界中，可引起食物中毒、腹瀉、化膿性炎癥以及敗血癥等[3-4]。近年來，養(yǎng)殖業(yè)中被奇異變形桿菌感染的報道激增，如雞[5]、鵝[6]、孔雀[7]、牛[8]、水貂[9]、山羊[10]、狐貍[11]、豬[2]等動物在感染該致病菌后會表現(xiàn)出很多發(fā)病癥狀，最明顯的有厭食、神情低落、畏寒、腹瀉、扎堆、流產(chǎn)，在短期內(nèi)急速死亡，對養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近些年來，養(yǎng)殖場抗生素類藥物加劇使用以及不規(guī)范使用，甚至濫用，導(dǎo)致致病菌對抗生素類藥物的耐藥性與日俱增，生物體內(nèi)致病菌通過異化而產(chǎn)生的耐藥基因也越來越多。添加抗生素類藥物耐藥基因，就會加大致病菌對于不同抗生素的耐藥概率，給養(yǎng)殖業(yè)動物的飼養(yǎng)及臨床治療造成了巨大的挑戰(zhàn)。

在2019年夏季，四川省峨眉山市某養(yǎng)殖場出現(xiàn)大量幼兔發(fā)病，主要癥狀為精神萎靡、食欲不振、黃色瓢性稀便，在1周內(nèi)死亡。對該養(yǎng)殖場病死兔進行解剖，病死兔經(jīng)解剖多數(shù)可見肝臟及腎臟出血腫大、肺部有出血點。取病變組織進行細菌分離鑒定、生化試驗，再通過測定16SrRNA基因序列并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析同源性，確定分離出1株奇異變形桿菌，并對其進行藥敏試驗及耐藥基因檢測，以期在分子水平上為奇異變形桿菌引起的兔病變死亡的診斷及治療提供案例分析和參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1被檢材料

本試驗所用的病料來自峨眉山市某養(yǎng)殖兔場。

1.2主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、細菌生化鑒定管、藥敏片等，均購自杭州微生物試劑有限公司。PCR相關(guān)試劑、細菌DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等，均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3主要儀器

Motic光學(xué)顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）;超凈工作臺、立式電熱壓力滅菌鍋（青島海爾股份有限公司）;全溫空氣搖床、恒溫培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）;PCR儀、電泳儀[美國SelectBioProducts（SBP）公司];凝膠成像系統(tǒng)（德國耶拿分析儀器股份有限公司）。

1.4細菌分離與革蘭氏染色

用接種環(huán)無菌挑取病變組織，接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取疑似菌落進行純培養(yǎng)，再挑取優(yōu)勢單個菌落分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上，觀察記錄疑似菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況。挑取純培養(yǎng)物涂片后，進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)。

1.5生化試驗

將普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物分別接種于細菌微量生化管中，37℃培養(yǎng)24h后，觀察記錄結(jié)果。

1.6藥敏試驗

將分離得到的菌株，采用國際通用的K-B紙片法[12]，對每一種所試抗菌藥物進行體外敏感藥物篩選試驗。結(jié)果參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，簡稱CLSI）制定的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準進行判定。

1.716SrRNA基因擴增及序列測定

挑取已純化的菌落，接種于普通肉湯液體培養(yǎng)基上進行擴大培養(yǎng)，直至肉眼可見試管中菌液渾濁即增菌完成，收集菌液進行離心。使用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA。PCR擴增參考通用引物序列：rmtc-F，5′-[JP9]AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;rmtc-R，5′-[JP9]AAGGAGGTGAGCCAGCCGCA-3′。

PCR反應(yīng)體系為25μL體系：2×TaqMix12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。

取5μLPCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNAmarker作為參照。電泳成功后將膠體放入凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察，切下目的條帶做膠回收試驗，參照DNA凝膠回收試劑盒說明書進行操作，膠回收完成后將回收的目的條帶送往北京擎科生物科技有限公司成都分公司測序。

1.816SrRNA系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將分離菌測序結(jié)果進行拼接編輯，再與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的10種不同來源的變形桿菌（表1）進行BLAST（basiclocalalignmentsearchtool）比對，用DNAStar軟件進行同源性分析，應(yīng)用Mega7.0軟件構(gòu)建16SrRNA系統(tǒng)進化樹，確定分離菌株的種屬。

1.9耐藥基因檢測

1.9.1引物設(shè)計

參照文獻[13-17]，并自行依據(jù)引物設(shè)計原則（引物長度為15～30bp/18～27bp，不得超過38bp，且GC含量為45%～55%最好）分別設(shè)計合成3種常見的廣譜抗生素類藥物引物，所有耐藥基因的引物序列、體外擴增產(chǎn)物長度及退火溫度見表2。

1.9.2耐藥基因PCR檢測

以分離菌的基因組DNA為模板，用不同耐藥基因的引物進行PCR擴增。其反應(yīng)體系和反應(yīng)循環(huán)條件參照“1.6”節(jié)（不同的引物具有不同的退火溫度見表2）。PCR反應(yīng)結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1細菌分離與革蘭氏染色

從病變組織中分離出了1株具有共性且具有鑒定意義的菌株，將該分離菌株命名為T2019。它在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、灰白色，有腐敗臭味，中間稍微突起，有透明的單個菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形、扁平、半透明、表面光滑的菌落;在血瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色菌落，無溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色鏡檢可見分離菌株多數(shù)為中等大小，以短桿狀為主，大多單個存在，兩端鈍圓的革蘭氏陰性細菌。結(jié)合菌落和菌體特征，初步判定分離菌T2019疑似為奇異變形桿菌。

2.2生化試驗

生化試驗結(jié)果見表3，根據(jù)《伯杰氏鑒定細菌學(xué)手冊》，分離菌T2019的生化鑒定結(jié)果與奇異變形桿菌基本一致。

2.3藥敏試驗

由表4可知，分離菌T2019除對米諾環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)為敏感，對四環(huán)素和多西四環(huán)素表現(xiàn)為中介以外，對其他所試抗生素均表現(xiàn)為耐藥。

2.416SrRNA基因PCR擴增

擴增結(jié)果見圖1，得到1條清晰的、大小約為1500bp的條帶，與可查證的奇異變形桿菌的特異性條帶大小接近，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.516SrRNA同源性比對和遺傳進化分析

結(jié)果（表5、圖2）顯示，分離菌株T2019與發(fā)表的菌株NCTC11938（GenBank登錄號為MN326692.1）同源性最接近，高達100%，NCTC11938菌株是從印度的動物懶熊糞便中分離得來，鑒定為奇異變形桿菌，由此從分子水平上可將分離株T2019確定為奇異變形桿菌。

2.6耐藥基因的檢測結(jié)果

耐藥基因經(jīng)PCR檢測后，ant（3″）-I、strA、sul2和tetB基因電泳檢測結(jié)果片段大小與預(yù)期片段大小一致;除此之外，其他所試耐藥基因均未檢出（圖3至圖5）。

3討論與結(jié)論

奇異變形桿菌病是近些年在動物中多發(fā)的急性細菌性傳染病，發(fā)病率主要集中在豬、雞、羊等家禽中，兔感染奇異變形桿菌的報道較為少見。本研究從腹瀉死亡的幼兔腸道中分離得到1株疑似病原菌進行鑒定，對分離菌進行了革蘭氏染色、生化鑒定、16SrRNA基因序列分析，最終確定分離菌株為奇異變形桿菌。奇異變形桿菌為多種動物易感的致病菌，對于不同種群和不同習(xí)性的動物感染后的臨床表現(xiàn)有所差異，在哺乳動物中常見腹瀉、肺炎等癥狀。近年有新研究發(fā)現(xiàn)，感染奇異變形桿菌可導(dǎo)致動物流產(chǎn)，但目前僅見于少數(shù)動物，如狐貍[18]。

奇異變形桿菌的主要毒力因子包括鞭毛、菌毛、尿素酶等，該菌的鞭毛有利于其在普通細胞中定植，在感染動物機體時，首先附著于機體防御較弱的部位以及傷口處進行大量繁殖，通過分泌特定蛋白來破壞細胞表面，進而進入細胞內(nèi)部，開始分泌大量致病因子，毒力因子與受染細胞結(jié)合使細胞正常功能改變，最終侵害動物機體[1]。

近年來，由于抗生素的大量濫用，大量致病菌都表現(xiàn)出對相應(yīng)藥物的耐藥性，奇異變形桿菌也不例外，其對多種抗生素表現(xiàn)出高度耐藥性。在養(yǎng)殖業(yè)中，商戶大都偏愛在飼料中添加抗生素，但抗生素的不規(guī)范添加會直接導(dǎo)致細菌變異產(chǎn)生耐藥基因，各類飼料添加劑也會對致病菌的耐藥性產(chǎn)生影響。在獸醫(yī)臨床中，抗生素的濫用導(dǎo)致原始劑量已無法達到治療效果，必須加大劑量投入才能顯示藥效，這對養(yǎng)殖業(yè)大為不利，不僅增加了飼養(yǎng)成本，也將動物病程延長，影響動物生產(chǎn)性能，且使用大量的抗生素容易在動物體內(nèi)積累，當(dāng)動物排便或死亡后，抗生素重新堆積于土壤和污水中，對環(huán)境造成污染，且可能會有耐藥基因二次傳遞的危險[19]。所以要想避免感染奇異變形桿菌對自身養(yǎng)殖業(yè)造成損失，最重要的方法在于如何防止細菌感染和傳播，首先要確保養(yǎng)殖場的環(huán)境衛(wèi)生，及時清理動物糞便，不要過度密集地養(yǎng)殖，保持通風(fēng)，每周進行3～4次的全方位清潔并消毒，將動物放出棚外進行戶外運動，保持身心愉悅;其次，注意飼料中抗生素的添加，按照相關(guān)說明規(guī)范合理地添加抗生素，切勿秉持多種類多數(shù)量的觀念;最后，若養(yǎng)殖場出現(xiàn)患病動物，及時將其隔離，進行全面消毒，無害化處理患病動物的排泄物，防止對環(huán)境造成污染，制造疾病傳播源。

參考文獻：

[1]劉燕云，柴家前.奇異變形桿菌研究進展[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2017，37（1）：196-198.

[2]趙振鵬，楊振，林偉東.豬源奇異變形桿菌的分離鑒定及集群運動分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（10）：219-224.

[3]王曉松.一起由奇異變形桿菌引起食物中毒的調(diào)查[J].職業(yè)與健康，2008，24（13）：83.

[4]朱明華，朱瑞良，馬榮德，等.雞奇異變形桿菌的分離鑒定和16SrRNA基因序列測定與系統(tǒng)進化分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31（6）：804-808.

[5]徐睿，李顏桃.雞源致病性奇異變形桿菌的分離鑒定與遺傳進化分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2018，45（9）：2550-2558.

[6]王巖，尹珺伊，侯美如，等.鵝源奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國家禽，2017，39（23）：56-59.

[7]李迎曉，焦鳳超，潘志明，等.孔雀奇異變形桿菌的分離鑒定及遺傳進化分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2016，48（5）：79-81.

[8]曾邦權(quán)，段博芳，鄭歡莉，等.牛奇異變形桿菌的分離鑒定及16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2018，34（4）：77-79.

[9]王建科，程悅寧，易立，等.水貂奇異變形桿菌的分離鑒定及16SrRNA基因序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（4）：852-858.

[10]陳曦，王遠微，王永.山羊腹瀉糞便中奇異變形桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（8）：215-218.

[11]段二珍，夏平安，張鳳華，等.狐貍奇異變形桿菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（12）：1050-1054.

[12]馬越，李景云，金少鴻.美國臨床實驗室標準委員會推薦藥敏試驗操作方法和判斷標準（2005年修訂版）[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005（17）：1182-1184.

[13]陳紅梅，程龍飛，鄧輝，等.鴨源多殺性巴氏桿菌對磺胺類藥物的耐藥性檢測及耐藥基因分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（1）：223-230.

[14]晏云濤，俸江琴，趙汝，等.豬源大腸桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥性及耐藥基因檢測[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：222-224.

[15]黃偉德，肖雙燕，黎姍梅，等.廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性和耐藥基因的檢測[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，31（9）：1979-1988.

[16]楊明偉，韋慕蘭，羅福廣，等.羅非魚源無乳鏈球菌對氨基糖苷類耐藥性及耐藥基因檢測[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，31（11）：2438-2444.

[17]楊艷，王厚照，張玲.多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類修飾酶與16SrRNA甲基化酶基因的研究[J].微生物學(xué)雜志，2017，37（4）：28-33.

[18]張萍，程悅寧，張海威，等.狐貍流產(chǎn)奇異變形桿菌的分離鑒定及特征分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（11）：3370-3377.

[19]邊海霞，王學(xué)強，周云鋒，等.雞奇異變形桿菌的研究[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2017（4）：189.