解淀粉芽孢桿菌ck-05發(fā)酵液的抑菌活性

劉小玉　付登強(qiáng)　劉立云　齊蘭

摘要：對解淀粉芽孢桿菌ck-05菌株發(fā)酵液中生物活性物質(zhì)的抑菌作用及穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。采用菌絲生長速率法測定菌株ck-05發(fā)酵液對11種病原菌的抑菌作用。結(jié)果表明，ck-05菌株發(fā)酵液對供試植物病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，其中對香蕉枯萎病的抑制性最強(qiáng)，抑菌率達(dá)82.22%。另外，以香蕉枯萎病為指示菌，測定不同條件下ck-05菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性。結(jié)果表明，發(fā)酵液熱穩(wěn)定性較好;對酸堿性條件比較敏感，pH值為6～8時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌作用;紫外線和自然光照射下穩(wěn)定性較好，對蛋白酶不敏感。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌ck-05;抑菌活性;穩(wěn)定性;生長速率法;香蕉枯萎病;發(fā)酵液

中圖分類號：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）04-0078-04

作者簡介：劉小玉（1986—），女，江西九江人，碩士，助理研究員，主要從事土壤微生物方面的研究。E-mail：liuxiaoyu06120210@163.com。

近年來，化肥的施用為作物產(chǎn)量的提高做出了突出貢獻(xiàn)，但盲目過量施用化肥，造成部分地區(qū)植物土傳病害日益加重[1]。利用化學(xué)藥劑防治植物病害會(huì)引起諸多副作用，生物防治逐漸成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種新的發(fā)展趨勢。解淀粉芽孢桿菌具有廣泛抗菌能力，屬革蘭氏陽性芽孢桿菌。有研究表明，解淀粉芽孢桿菌通過產(chǎn)生吲哚-3-乙酸（IAA），分泌葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶以及抗菌活性物質(zhì)，達(dá)到防治植物病害的目的[2-3]。筆者所在課題組在前期工作中獲得解淀粉芽孢桿菌菌株ck-05，為進(jìn)一步將該菌株應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，對該菌株發(fā)酵液的抑菌活性及不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為將該菌株開發(fā)為生物農(nóng)藥提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年在海南省文昌市文清大道496號椰子研究所實(shí)驗(yàn)室（19°33′12″N，110°47′14″E）開展。

1.2供試菌株及培養(yǎng)基[4]

解淀粉芽孢桿菌ck-05和11種病原菌（檳榔炭疽病、椰子莖腐病、菜心炭疽病、油茶炭疽病、油棕心腐病、椰子灰斑病、板栗疫病、香蕉枯萎病、油茶葉斑病、檳榔心腐病、花生果腐病）均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所實(shí)驗(yàn)室保藏。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：5g酵母粉，10gNaCl，10g蛋白胨，18～20g瓊脂，1L水，pH值為7.0～7.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200g土豆，20g葡萄糖，18～20g瓊脂，1L水。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20g葡萄糖，20g蛋白胨，0.8g無水氯化鈣，1.3gK2HPO4，0.2gMgSO4，0.8gMnSO4·H2O，pH為值7.0～7.2。

1.3無菌發(fā)酵液的制備[5]

將活化的菌株ck-05接入LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h（D600nm>0.8）為種子液。將種子液分別按體積分?jǐn)?shù)5%接入滅好菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵培養(yǎng)48h。發(fā)酵液10000r/min離心20min，上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，得到菌株ck-05無菌發(fā)酵液。

1.4ck-05發(fā)酵液抑菌譜的測定

將10mLck-05菌株發(fā)酵液與90mLPDA培養(yǎng)基混合均勻，制成含菌株ck-05無菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基平板。分別在平板中央接入11種不同的供試病原菌菌塊（5mm），以10mL無菌水為對照（CK）。置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組菌落長滿培養(yǎng)皿時(shí)，采用十字交叉法測量各處理組菌落直徑，并計(jì)算無菌濾液的抑菌率[6-7]。

抑菌率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.5ck-05發(fā)酵液的穩(wěn)定性測定

1.5.1熱穩(wěn)定性

在40、60、80、100℃條件下，分別將ck-05菌株發(fā)酵液處理30、60、120min及121℃滅菌20min[8-9]，測定ck-05無菌發(fā)酵液對香蕉枯萎病的抑菌率，CK為不作溫度處理的發(fā)酵液。待觀察并測量各處理組菌落直徑，并計(jì)算抑菌率，計(jì)算方法同上。

1.5.2酸堿穩(wěn)定性pH值設(shè)為1.0～13.0等13個(gè)梯度，用HCl和NaOH調(diào)整ck-05菌株無菌發(fā)酵液的pH值，靜置24h后調(diào)回發(fā)酵液原始pH值（pH值=7.2），測定ck-05無菌發(fā)酵液對香蕉枯萎病的抑菌率[9]。

1.5.3紫外線穩(wěn)定性

將ck-05菌株發(fā)酵液置于距離30W紫外燈30cm處，紫外線照射時(shí)間分別設(shè)為10、20、30、40、50、60min等不同處理，測定ck-05無菌發(fā)酵液對香蕉枯萎病的抑菌率[10]。

1.5.4光照穩(wěn)定性將ck-05菌株無菌發(fā)酵液在自然光下照射4、8、12、16、20、24h，測定ck-05無菌發(fā)酵液對香蕉枯萎病的抑菌率[10-11]。

1.5.5酶穩(wěn)定性酶的終質(zhì)量濃度為50mg/L，溫度設(shè)為37℃。用胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶處理ck-05菌株發(fā)酵液，分別處理0.5、1.0、1.5、2.0h，測定ck-05無菌發(fā)酵液對香蕉枯萎病的抑菌率，得出蛋白酶耐受性[10，12]。

2結(jié)果與分析

2.1ck-05菌株無菌發(fā)酵液的抑菌譜測定

由表1可知，ck-05菌株發(fā)酵液除對菜心炭疽病病菌的抑菌作用為43.47%外，對其他10種供試病原菌的抑菌率均達(dá)到50%以上，發(fā)酵液對香蕉枯萎病的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)82.22%，其次為花生果腐病病菌和椰子莖腐病病菌，抑菌率分別為79.44%和78.89%。由此可見，ck-05菌株發(fā)酵液抗菌范圍較廣。

2.2ck-05菌株發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

以香蕉枯萎病病菌為指示菌，由圖1可知，經(jīng)過不同溫度處理后，ck-05菌株發(fā)酵液仍具有較強(qiáng)的抑菌作用，熱穩(wěn)定性較好。40、60、80℃處理不同時(shí)間后抑菌作用無明顯變化，但溫度高于80℃處理后發(fā)酵液抑菌活性明顯下降，100℃高溫處理120min后發(fā)酵液抑菌率為31.48%，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌后發(fā)酵液抑菌率僅為19.26%。當(dāng)溫度達(dá)到100℃后，ck-05菌株發(fā)酵液的抑菌率明顯降低，這可能是由于高溫能夠使其抑菌活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致活性物質(zhì)變性失活，最終使發(fā)酵液抑菌活性下降。

2.3ck-05菌株發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

由圖2可知，ck-05菌株發(fā)酵液的抑菌活性對pH值較敏感。pH值為7時(shí)，其發(fā)酵液抑菌活性最大，pH值為5時(shí)，抑菌率為44.44%;pH值為3時(shí)，抑菌率為27.41%，pH值為1時(shí)，抑菌率僅為10.00%，與對照組CK相比分別下降34.43%、59.56%、85.25%，pH值為9時(shí)，抑菌率為50.00%、pH值為11時(shí)，抑菌率為22.59%;pH值為13時(shí)，抑菌率僅為7.78%，與對照CK相比分別下降26.23%、66.67%、88.52%。

2.4ck-05菌株發(fā)酵液的紫外線照射穩(wěn)定性

紫外線照射穩(wěn)定性是抑菌活性物質(zhì)開發(fā)藥品、食品防腐劑的重要指標(biāo)，若紫外穩(wěn)定性差將會(huì)降低藥效[13]。由圖3可知，與對照CK相比，經(jīng)紫外線照射30min內(nèi)，ck-05菌株發(fā)酵液抑菌率下降較小;40min后隨著紫外線照射時(shí)間不斷延長，抑菌活性明顯降低，但紫外線照射60min時(shí)其抑菌率仍在40%以上。由此可知，ck-05菌株發(fā)酵液的抑菌活性受紫外線照射的影響較小，該結(jié)果與葛平華等的報(bào)道[8]一致。

2.5ck-05菌株發(fā)酵液的自然光照穩(wěn)定性

由圖4可知，ck-05菌株發(fā)酵液在自然光照射0～24h后，其抑菌活性均無明顯變化。當(dāng)持續(xù)光照24h后，ck-05菌株發(fā)酵液仍具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率為64.81%，與CK相比，其抑菌率變化不明顯，由此可見，ck-05菌株發(fā)酵液的抑菌活性受自然光照的影響較小。

2.6ck-05菌株發(fā)酵液的蛋白酶穩(wěn)定性

由圖5可知，不同蛋白酶對ck-05菌株發(fā)酵液的抑菌活性影響不明顯，說明其發(fā)酵液的抑菌作用對3種供試蛋白酶均不敏感。

3討論與結(jié)論

李楊等研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌ZJ01對蘋果輪紋病病菌有較強(qiáng)的抑制作用[14]。王曉輝等認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌K1發(fā)酵液可有效抑制灰霉病病菌的生長[15]。Caldeira等認(rèn)為，菌株CCMI1051能較強(qiáng)地抑制哈茨木霉及根霉生長，抑菌作用分別為74.7%、99.8%[16]。張寶俊等從解淀粉芽孢桿菌LP-5中獲得1種對梨黑斑病病菌具有較強(qiáng)抑制作用的抗菌蛋白[17]。EvaArrebola等研究表明，菌株P(guān)PCB004能有效抑制青霉屬真菌的菌絲生長，其中對殼青霉菌的抑菌率達(dá)73.3%[18]。解淀粉芽孢桿菌的抑菌機(jī)制表現(xiàn)在不同的方面，不同的菌株其抑菌機(jī)制可能不同，但主要是產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。抑菌活性物質(zhì)主要有甜蛋白、抗生素肽類物質(zhì)、伊枯草菌素、芬枯草菌素、表面活性素、幾丁質(zhì)酶、芽孢素類和細(xì)菌素等[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌ck-05發(fā)酵液對11種供試植物病原菌的菌絲生長均具有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是對香蕉枯萎病的抑菌作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)82.22%。以香蕉枯萎病病菌為指示菌，ck-05菌株發(fā)酵液在溫度低于80℃時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性;對酸堿性條件比較敏感，pH值為6～8時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌作用;紫外線和自然光照射下穩(wěn)定性較好，對蛋白酶不敏感。該菌株發(fā)揮抑菌作用的具體活性物質(zhì)及抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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