老齡兔心房電生理特征及其與心房顫動(dòng)的易感性

胡偉芳 張兵 劉磊 吳萍 李小紅 黃雪淵

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF)是臨床上最常見的房性心律失常,老齡化是其最常見的病因,具有獨(dú)立危險(xiǎn)性[1]。其原因可能與老齡化心房出現(xiàn)電沖動(dòng)傳導(dǎo)速度下降,動(dòng)作電位形態(tài)異常,心房肌細(xì)胞離子通道結(jié)構(gòu)和功能選擇性改變?yōu)樘卣鞯碾娭貥?gòu)密切相關(guān)[2]。筆者觀察老齡兔電生理活動(dòng)的改變,探討老齡易于發(fā)生AF的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 青齡和老齡的雄性新西蘭大耳白兔,各15只,購自武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心。青齡兔為性成熟成年個(gè)體[兔齡5～10個(gè)月,體重(2 500.9±55.3)g];老齡兔為老年個(gè)體[兔齡22±3個(gè)月,體重(5 000.6±100.8)g]。動(dòng)物從購回到用于實(shí)驗(yàn)前均飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。實(shí)驗(yàn)分為青齡組和老齡組,飼養(yǎng)2周后進(jìn)入相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)溶液和試劑 Tyrode 液成分(mmol/L):NaCl 135.0、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.0、Na H2PO40.33、HEPES 10.0、Glucose 10.0,p H用NaOH 調(diào)至7.35。無Ca2＋Tyrode液和含有0.2 mmol/L Ca2＋的Tyrode液分別為Tyrode 液中無CaCl2和僅加0.2 mmol/L CaCl2。短暫外向鉀電流(Ito)細(xì)胞外液成分(mmol/L):NaCl 35.0、氯化膽堿100.0、KCl 5.4、MgCl21.0、Na H2PO40.33、HEPES 10.0、Glucose 10.0,p H 用NaOH 調(diào) 至7.35。Ito電極內(nèi)液成分(mmol/L):KCl 45、K-aspartate 85、Na-pyruvate 5、Mg ATP 5.0、EGTA 10.0、HEPES 10.0、Glucose 10.0,p H 用KOH 調(diào)至7.3。其中,用于阻滯Ca2＋和Na＋電流的Cd Cl2和BaCl2,以及消化心肌組織的膠原酶Ⅰ和蛋白酶E 均購于Sigma公司,TTX 購于大連水生研究所,其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 ECG 記錄 隨機(jī)選取各組兔(每組10只)背仰臥捆綁于帶有溫控(37℃)電熱毯的動(dòng)物臺(tái)上,用16導(dǎo)電生理系統(tǒng)(Power Lab 16/30,澳大利亞)記錄兔清醒狀態(tài)下(非麻醉)2 h的Ⅱ?qū)?lián)心電圖(normalⅡelectrocardiogram,ECG-Ⅱ,濾過率為0.1～100 Hz)。后用系統(tǒng)自帶兔的標(biāo)準(zhǔn)化記錄和分析模塊(LabChart Pro V7,澳大利亞)測(cè)量和分析連續(xù)記錄、無干擾和走形穩(wěn)定的20個(gè)P-QRS波群。觀察測(cè)量P波間 期、P波 離散度、PR 間期、RR 間期、QT間期和心率。

1.4 單相動(dòng)作電位(MAP)記錄 用戊巴比妥鈉(300 mg/Kg)經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉上述記錄完ECG的兔,按外科無菌手術(shù)操作開胸,開瞼器撐開胸廓充分暴露心臟視野,剪開心包膜,用與生物電放大器、連接的微電極接觸自律心率下離左心耳稍遠(yuǎn)、靠近房間隔的左心房前壁,記錄電信號(hào)經(jīng)16導(dǎo)數(shù)模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換并由濾波器(0.3 Hz～1 KHz)濾過形成MAP后顯示到計(jì)算機(jī)上。用系統(tǒng)自帶記錄和分析模塊測(cè)量、分析和統(tǒng)計(jì)。觀察主要參數(shù)及其意義同參考文獻(xiàn)[3],包括從動(dòng)作電位0期開始除極到1期開始復(fù)極恢復(fù)到10%、20%、90%的時(shí)程(APD10、APD20和APD90)、動(dòng)作電位平臺(tái)期電位(plateau potential,plateau P)和最大上升速率(maximum upstroke velocity,Maxdv/dt)。

1.5 心房有效不應(yīng)期(AERP)和AF 誘發(fā) 記錄MAP電極位置、記錄信號(hào)及其數(shù)模轉(zhuǎn)換形成動(dòng)作電位圖形不變,將另一對(duì)連接刺激器(Grass S88,美國)的電極(用銀絲自制而成)置于右房心外膜對(duì)心房進(jìn)行程控刺激,按每8個(gè)基礎(chǔ)刺激周長(basic cycle lengths,BCLs)S1后發(fā)出一個(gè)期前刺激S2進(jìn)行,BCLs分別為300、200和150 ms,刺激電壓為2倍的舒張期閾值,偶聯(lián)間期分別從300、200和150 ms開始,以5 ms步長反掃遞減,直到S2誘發(fā)激動(dòng)被奪獲,此時(shí)的S1S2偶聯(lián)間期分別定義為300、200和150 ms的AERP。系統(tǒng)自帶的兔標(biāo)準(zhǔn)化記錄和分析模塊測(cè)量、分析和統(tǒng)計(jì),同一部位重復(fù)起搏3次并記錄3次,取平均值。觀察指標(biāo)包括BCLs分別為300、200 和150 ms的AERP 的平均值,AERP離散度(dispersion of AERP,d ERP,即同一個(gè)BCLs過程中記錄到最長與最短AERP的差值),和頻率自適應(yīng)性(frequency self adaptation of AERP,f ERP,即最長與最短BCLs測(cè)得的AERP差值)。

完成上述實(shí)驗(yàn),兔依然存活的情況下,按S1S1的BCLs依次為200 ms至20 ms,按10 ms遞減,每個(gè)BCLs的脈寬為2 ms,持續(xù)時(shí)間10 s,直至誘發(fā)AF(心房頻率超過500次/分,并伴有不規(guī)則的房室傳導(dǎo))。觀察指標(biāo)包括誘發(fā)AF的BCLs、誘發(fā)率。

1.6 Ito記錄及其電流-電壓(I-V)擬合 將各組做完電生理實(shí)驗(yàn)剩下兔經(jīng)耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(300 mg/Kg)麻醉和肝素鈉(500 IU/Kg)抗凝,10 min后手術(shù)摘下整體心臟,行Langendorff灌流(流速18～20 ml/min,37℃,100% O2飽和),先用正常臺(tái)式液灌流10 min,再用含2種消化酶(膠原酶Ⅰ0.33 mmol/L;蛋白酶E 0.25 mmol/L)的無Ca2＋臺(tái)式液灌流10 min,后用正常臺(tái)式液沖洗5 min終止消化,取下心臟去除心室,留下心房肌組織在正常臺(tái)式液中剪碎,震蕩,過濾反復(fù)3 次,最后離心、稀釋,獲得密度為5×105/ml的心房肌細(xì)胞懸液,供膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

先將細(xì)胞懸液加于倒置顯微鏡(IX70-122,Olympus,日本)的載物臺(tái)上的細(xì)胞記錄槽中,等細(xì)胞靜置沉底貼壁,用記錄Ito細(xì)胞外液循環(huán)灌流10 min。后在Pulse＋Pulsefit軟件(version8.31,HEKA,德國)的控制下,使指令程序和記錄信號(hào)經(jīng)放大器(EPC-9,HEKA,德國)轉(zhuǎn)換和放大,通過充灌Ito電極內(nèi)液、電阻為2.5～3.5 MΩ 的玻璃微電極與細(xì)胞封接直到電阻達(dá)1 GΩ 以上,補(bǔ)償快電容,施加負(fù)壓吸破細(xì)胞膜并作慢電容和漏電容補(bǔ)償,形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。設(shè)置電壓鉗制方案:先給一個(gè)－80 m V 至－50 m V、持續(xù)時(shí)間20 ms預(yù)鉗制電壓,再給予鉗制電壓－50 m V,指令電壓由－50 m V 到＋50 m V,躍階10 m V,鉗制時(shí)間300 ms。獲得各組電流的數(shù)據(jù)經(jīng)Pulse軟件采集并存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)的硬盤中,后用分析軟件(version 3.31,Igor Pro,美國)對(duì)實(shí)驗(yàn)圖形進(jìn)行擬合分析處理。為消除每個(gè)細(xì)胞大小對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成誤差,電流大小用電流密度(p A/p F)表示。Ito的I-V 曲線是以各自指令電位為橫坐標(biāo),相對(duì)應(yīng)的電流密度為縱坐標(biāo)作圖完成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Origin 6.0(Microcal公司,美國)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示,正態(tài)分布采用方差分析,兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示,采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 二組ECG 參數(shù)比較 與青齡組比較,老齡組P波間期、P波離 散 度、PR 間 期、RR 間 期 和QT 間期均延長,心率減慢(P 均＜0.05),見表1。

2.2 二組MAP比較 與青齡組比較,老齡組平臺(tái)期變窄,復(fù)極相增寬,同步記錄MAP個(gè)數(shù)減少。老齡組兔的APD10和APD20縮短,平臺(tái)期電位絕對(duì)值增高,APD90延長以及最大上升速率加快(P 均＜0.05),見圖1,表2。

表1 二組兔的ECG 主要參數(shù)比較

圖1 二組MAP形態(tài)特征比較

表2 二組MAP參數(shù)比較

2.3 兩組心房肌組織程控刺激主要參數(shù)比較 與青齡組比較,老齡組兔AERP 和f ERP 縮短,d ERP和誘發(fā)AF的BCL延長更加明顯(P 均＜0.01),AF誘發(fā)率增加亦更顯著(P＜0.05),表現(xiàn)為AMP變?yōu)樾螒B(tài)不規(guī)則,且持續(xù)時(shí)間較長的觸發(fā)性電活動(dòng)。見表3,圖2。

表3 二組兔心房肌組織程控刺激主要參數(shù)比較

圖2 二組在Burst刺激模式誘發(fā)AF的形態(tài)特征比較

2.4 二組心房肌細(xì)胞Ito及其I-V 曲線比較 在電壓鉗制方案下,2組心房肌細(xì)胞Ito隨著鉗制電壓的增加均在上升,且在相同鉗制電壓下,老齡組兔心房肌細(xì)胞Ito較小。從I-V 曲線中發(fā)現(xiàn),老齡組兔心房肌細(xì)胞Ito的I-V 曲線明顯下移,處于青齡組兔心房肌細(xì)胞Ito的I-V 曲線以下。當(dāng)鉗制電位為＋50 m V時(shí),老齡組兔心房肌細(xì)胞Ito為(12.8±0.9)p A/p F,較青齡組兔心房肌細(xì)胞Ito的(16.8±0.7)p A/p F 顯著減小(P＜0.01,n＝10)。見圖3。

圖3 二組心房肌細(xì)胞Ito及其I-V 曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),老齡兔心率明顯減慢,心電圖的P波和PR 間期等主要參數(shù)均顯著延長,特別是P波離散度增加嚴(yán)重,這些體表心電圖數(shù)據(jù)的變化預(yù)示老齡心臟電生理特性發(fā)生了改變,另一方面提示老齡化心房電活動(dòng)基礎(chǔ)特征與青齡心臟有明顯不同[4]。這在本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的觀察結(jié)果中也可發(fā)現(xiàn),在老齡兔心房肌組織上,動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短,電位降低,而終末復(fù)極相動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長,最大上升速率減小,提示人的心臟在從青齡進(jìn)入老齡階段中,心臟電生理基本特征發(fā)生了電重構(gòu),表現(xiàn)為行進(jìn)于心房組織中電沖動(dòng)形成和下傳放緩、受抑制或間斷,正常電活動(dòng)不能按規(guī)律性生成或下傳,心房舒張間期擁有更長的時(shí)間窗口,甚至出現(xiàn)電沖動(dòng)擴(kuò)布的不均一性[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),老齡心房的ERP明顯縮短,其離散度在增大,自適應(yīng)性在減小此為折返性房性心律失常發(fā)生提供了條件和途徑。從而在額外刺激下,即使較長程控刺激條件下,就能誘發(fā)房性心律失常甚至AF,對(duì)AF發(fā)生具有明顯易感性[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明老齡化心房發(fā)生了電重構(gòu),對(duì)房性心律失?；駻F具有顯著易感性。而對(duì)于老齡化心臟出現(xiàn)的電沖動(dòng)減慢,動(dòng)作電位復(fù)極化時(shí)程延長,平臺(tái)期電位降低,其細(xì)胞離子通道基礎(chǔ)多與外向鉀電流下調(diào)和(或)內(nèi)向電流上調(diào),引起電壓依賴性復(fù)極化K＋電流激活減緩,外向性鉀電流流動(dòng)減少相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在電壓鉗制方案下,老齡兔心房肌細(xì)胞Ito的電流密度明顯減小,I-V 曲線下移,提示兔的心臟在老齡后心房肌細(xì)胞外向型鉀電流出現(xiàn)顯著減少改變,允許心房肌細(xì)胞漿中K＋經(jīng)細(xì)胞膜流出道胞外數(shù)量減小,離子通道的流速、流態(tài)放緩,出現(xiàn)離子通道重構(gòu),從而引起動(dòng)作電位復(fù)極化時(shí)程延長,平臺(tái)期電位下降[8]。