依普利酮通過下調(diào)VEGF表達抑制UUO模型大鼠對側腎臟血管新生并減輕腎臟纖維化*

楊漢繼，郝 娟，張雨軒，趙綺悅，高曉萌，劉令今，柴亞男，許慶友，2，3△

（1河北中醫(yī)學院研究生學院，2河北省中西醫(yī)結合肝腎病證研究重點實驗室，河北石家莊 050091；3河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院，河北石家莊 050200；4阿里地區(qū)人民醫(yī)院，西藏阿里 859000）

梗阻性腎?。╫bstructive nephropathy，ON）在中國占慢性腎臟病發(fā)病率的15.6%［1］，腎小管阻塞、多發(fā)性骨髓瘤、腎結石、腎積水、腎乳頭壞死脫落、輸尿管狹窄和腫瘤等都可導致尿路梗阻。單側梗阻介導的腎損傷進展為慢性腎衰竭的機制尚有不明之處。本團隊前期研究證實ON 可以激活鹽皮質(zhì)激素受體，誘導對側腎臟細胞增殖、焦亡，給予鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑可以減輕腎臟損傷［2-3］，進一步的研究顯示血管新生也參與纖維化形成。本研究觀察單側輸尿管結扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）后對側腎臟的血管新生，檢測血管內(nèi)皮細胞表面標志物CD34、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）、血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（serum/glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）和轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等的改變，并給予鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑依普利酮（eplerenone，EPL）治療，探討鹽皮質(zhì)激素受體活化刺激血管生成參與腎臟纖維化的作用。

材料和方法

1 動物及分組

清潔級雄性Wistar 大鼠30 只，7 周齡，體重（200±20）g，購買于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK（冀）2013-1-003。按照體質(zhì)量對大鼠進行編號，根據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為假手術（sham）組、模型（UUO）組和EPL 組，每組10 只。實驗動物于河北中醫(yī)學院肝腎病證重點實驗室適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

2 儀器和設備

RM2245 型石蠟切片機和CTS SP8 激光共聚焦掃描顯微鏡（LEICA）；ODYSSEY 雙色紅外激光成像掃描儀（LICOR）；DYY-12C型電泳儀及電泳槽（北京六一儀器廠）；半干轉膜儀（BIO-RAD）；臺式高速冷凍離心機（上海力申儀器公司）；VANOX DM-10AD型顯微照相儀（OLYMPUS）。

3 藥物與試劑

依普利酮購自Pfizer，由Research Diets Inc根據(jù)動物的進食量與藥物用量100 mg·kg-1·d-1按1.25 g/kg加入飼料中［2-3］。VEGF-A、VEGF 受體2（VEGF recep?tor 2，VEGFR2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）和CD34 抗體（Abcam）；SGK1 抗體（Af?finty）；TGF-β1 抗體（Bioworld）；GAPDH 抗體（Epito?mics）；核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體（Servicebio）；結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）抗體（Gene Tex）；E.Z.N.A.?To?tal RNA Kit II（Omega Bio-tek）；MonScriptTMRTIII Allin-One Mix和MonAmpTMChemoHS qPCR Mix（Monad）。

4 方法

4.1 造模方法及給藥 UUO 和EPL 組采用結扎單側輸尿管方法復制ON 模型［4］。采用異氟烷吸入麻醉后，切開左下腹，游離左側輸尿管，于上1/3 與下1/3處分別結扎輸尿管，剪斷中1/3處輸尿管，逐層縫合皮膚；sham 組只游離輸尿管但不結扎。UUO 術后，EPL 組以EPL（100 mg·kg-1·d-1）加入飼料中喂養(yǎng)。連續(xù)干預180 d后，異氟烷吸入麻醉，股動脈取血，摘取梗阻對側腎臟（右腎），沿縱軸切開，部分組織放置4%多聚甲醛固定或OCT 包埋，用于組織病理學的檢測，其余置于-80℃冰箱用于檢測相關指標。

4.2 天狼星紅染色觀察腎臟纖維化改變 石蠟切片于二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水至蒸餾水；PBS 清洗，苦味酸天狼星紅染色液滴染30 min；PBS 清洗，蘇木精復染10 min；PBS 清洗，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封固。普通光學顯微鏡及偏振光顯微鏡觀察膠原纖維表達。

4.3 免疫熒光檢測CD34、VEGF-A 及VEGFR2 的表達 將石蠟切片常規(guī)脫蠟、復水，加入3%H2O2去離子水，恒溫水浴箱內(nèi)孵育10 min；PBS 洗凈后加入0.01 mol 枸椽酸緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復；滴加10%山羊血清，室溫孵育1 h；傾倒多余的山羊血清，勿洗，I 抗（濃度為1∶100）4℃過夜；PBS 清洗，II抗（避光）37℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育1 h；滴加DAPI 液（避光）室溫孵育10 min；滴加抗熒光衰減封片劑（避光）封片。激光共聚焦顯微鏡觀測以上指標的表達。

4.4 免疫組化檢測SGK1、TGF-β1、TNF-α、NF-κB和CTGF 的表達 采用免疫組化法觀察腎組織中SGK1、TGF-β1、TNF-α、NF-κB 和CTGF 的表達，根據(jù)十三點評分法以0～4分來判定陽性細胞百分比［5］，以0～3 分判斷染色強度，最終將這2 個指標得分相乘以判斷陽性表達情況。

4.5 RT-qPCR 檢測腎組織中SGK1、TGF-β1 和NFκB 表達 使用E.Z.N.A.?Total RNA Kit II 提取腎組織總RNA。使用MonScriptTMRTIII All-in-One Mix并參照說明書步驟進行逆轉錄。使用MonAmpTMChe?moHS qPCR Mix 加入反應體系20 μL，三步法反應：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火10 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；熔解曲線95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。每組樣本至少重復3次，結束后得出各個樣本的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct），以GAPDH作為內(nèi)參照，將sham 組統(tǒng)計結果設為1，使用2-ΔΔCt法計算其余各組目的mRNA 相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR相關引物的序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

4.6 Western blot 檢測VEGF-A、VEGFR2、SGK1、TGF-β1、TNF-α 和CTGF 的表達 取腎組織100 mg，加入含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液400 μL，勻漿取上清，檢測蛋白濃度，根據(jù)檢測指標以20～50 μg蛋白樣品進行電泳并轉膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入Ⅰ抗VEGF-A、VEGFR2、SGK1、TGF-β1、TNF-α和CTGF［1∶（500～1000）］，4℃過夜，清洗，室溫孵育Ⅱ抗（1∶20 000），TBST 清洗后紅外激光成像掃描與所得內(nèi)參進行比較，采用ImageJ軟件統(tǒng)計分析。

5 統(tǒng)計學處理

用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（mean±SD）進行統(tǒng)計描述。多組間均數(shù)比較先采用單因素方差分析，再應用LSD/SNK法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 天狼星紅染色檢測各組大鼠腎臟膠原纖維改變

天狼星紅染色顯示，sham 組腎間質(zhì)僅見少量膠原纖維；UUO組腎小管間質(zhì)膠原纖維顯著增多，呈片狀或條索狀；EPL組腎小管間質(zhì)亦可見到片狀膠原纖維沉積，但較UUO 組顯著減少（圖1A）。偏振光顯微鏡下，Ⅰ型膠原表達為紅及黃色，Ⅲ型膠原表達為綠色，結果顯示腎間質(zhì)主要是Ⅰ型膠原沉積（圖1B）。

2 免疫熒光染色檢測CD34、VEGF-A 和VEGFR2的表達

免疫熒光標記CD34、VEGF-A 及VEGFR2 后，激光共聚焦顯微鏡觀察其表達。結果顯示，UUO 組腎小管間質(zhì)CD34 陽性表達較sham 組顯著增多，主要見于腎小管間質(zhì)，依普利酮可減少其表達；VEGF-A主要表達于腎小球內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞胞質(zhì)中，UUO 組較sham 組顯著增強，遠端腎小管上皮細胞尤為明顯，與CD34 表達一致，依普利酮可抑制其表達；VEGFR2 的表達趨勢與VEGF-A 基本相同，見圖2。

3 免疫組化檢測SGK1、TNF-α、TGF-β1、NF-κB和CTGF的表達

免疫組化結果顯示，sham 組SGK1 及TNF-α 呈弱表達，主要表達于遠端腎小管上皮細胞胞質(zhì)，UUO 組較sham 組表達顯著增強（P＜0.01），EPL 組的表達強度及范圍較UUO 組顯著減弱（P＜0.01）；TGF-β1在UUO組表達顯著增強（P＜0.01），而EPL可顯著降低TGF-β1 在腎小管上皮細胞的表達（P＜0.01）；UUO 組NF-κB 陽性表達較sham 組顯著增強（P＜0.01），主要見于細胞核，EPL 可顯著抑制其表達（P＜0.01）；CTGF 主要表達在腎小管上皮細胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)區(qū)域，在sham 組呈弱表達，在UUO 組表達顯著增強（P＜0.01），EPL 可降低其表達（P＜0.01），見圖3。

4 RT-qPCR 檢測SGK1、TGF-β1 和NF-κB 的mRNA表達

RT-qPCR 結果顯示，UUO 組對側腎臟SGK1、TGF-β1 和NF-κB 的表達顯著高于sham 組（P＜0.05），EPL組可下調(diào)其表達（P＜0.05），見圖4。

5 Western blot 檢測VEGF-A、VEGFR2、SGK1、TNF-α、TGF-β1和CTGF的表達

UUO 組腎臟VEGF-A、VEGFR2、SGK1、TNF-α、TGF-β1 和CTGF 的表達均較sham 組顯著升高（P＜0.05），EPL可下調(diào)其表達（P＜0.05），見圖5。

Figure 1.Fibrosis in contralateral kidney of UUO rats was detected by Sirius red staining（scale bar=100 μm）.A：optical micro?scope；B：polarization microscope.圖1 天狼星紅染色檢測UUO大鼠對側腎臟的纖維化情況

Figure 2.The protein expression of CD34，VEGF-A and VEGFR2 in contralateral kidney of UUO rats was detected by immunofluo?rescence staining.圖2 免疫熒光染色檢測UUO大鼠對側腎臟CD34、VEGF-A和VEGFR2的蛋白表達

Figure 3.The expression of SGK1，TNF-α，TGF-β1，NF-κB and CTGF in contralateral kidney of UUO rats was detected by immu?nohistochemistry（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs UUO group.圖3 免疫組化檢測UUO大鼠對側腎臟SGK1、TNF-α、TGF-β1、NF-κB和CTGF的蛋白表達

Figure 4.The mRNA expression of SGK1，TGF-β1 and NF-κB in contralateral kidney of UUO rats was detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs UUO group.圖4 RT-qPCR檢測UUO大鼠對側腎臟SGK1、TGF-β1和NF-κB的mRNA表達

Figure 5.The protein expression of VEGF-A，VEGFR2，SGK1，TNF-α，TGF-β1 and CTGF in contralateral kidney of UUO rats was detected by Western blot.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs UUO group.圖5 Western blot檢測UUO大鼠對側腎組織VEGF-A、VEGFR2、SGK1、TNF-α、TGF-β1和CTGF的蛋白表達

討論

ON 以單側發(fā)病居多，及早發(fā)現(xiàn)并解除梗阻后可全部或者部分恢復腎功能，但仍有部分患者持續(xù)進展至腎衰竭，其病理生理機制尚不明確。為了研究ON神經(jīng)體液失常引起的病理改變，我們采用UUO模型制備單側腎臟損傷模型，觀察長期梗阻后對側腎臟的改變，天狼星紅染色顯示180 d 后UUO 大鼠對側腎臟膠原纖維沉積增多，出現(xiàn)了明顯的間質(zhì)纖維化改變。

UUO 是制備腎間質(zhì)纖維化的經(jīng)典模型，廣泛應用于間質(zhì)纖維化的機制研究［4］。以往的研究主要關注在梗阻側，不重視對側腎臟的改變。隨著ON 發(fā)病率的增多并成為慢性腎衰竭的重要原因，對于失代償?shù)难芯恳矊㈥P注對側腎臟的改變。單側梗阻可引起腎臟壓力改變，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）［6-7］，刺激血管活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)的分泌，通過炎癥損傷和氧化應激等途徑［8-9］，誘導細胞焦亡［2］、自噬［10-11］等。這些損傷不僅影響梗阻側腎臟，對側腎臟、心臟和肺臟等都有影響。RAAS 的激活可以刺激血管緊張素Ⅱ、醛固酮等物質(zhì)的分泌，引起一系列病理生理學改變，參與臟器損傷。醛固酮具有調(diào)節(jié)水鈉代謝的作用，也是誘導炎癥的重要物質(zhì)，近年來眾多的臨床及動物實驗證實醛固酮在腎臟病進展中發(fā)揮著關鍵作用，成為慢性腎臟病的治療靶點［12］。醛固酮誘導的炎癥損傷通過激活鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorti?coid receptor，MR）發(fā)揮作用；MR的激活可通過配體依賴及非依賴方式實現(xiàn)，配體依賴方式與醛固酮的水平有關，若醛固酮水平不高時，可以通過配體非依賴途徑cAMP依賴性蛋白激酶A以及活性氧刺激MR的活化［13-14］。MR 一般以靜止形式存在于細胞質(zhì)，被激活后則轉位入核，然后刺激SGK1 表達增強［15］，故檢測SGK1的表達可證實醛固酮的效應［16］，本實驗結果顯示UUO 組SGK1 表達顯著增強。SGK1 還可激活NF-κB，刺激TNF-α、TGF-β1和CTGF的分泌，這些促炎、促纖維化機制均參與腎臟纖維化的形成［17-18］。

血管新生參與腎臟纖維化的進展［19］。血管新生也稱為血管生成（angiogenesis），與血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管形成有密切關系。血管新生的檢測采用血管內(nèi)皮細胞的標志物CD34、CD31、CD105 和CD146 等進行標記，其中CD34 能夠顯示所有的血管。血管生成涉及多種細胞因子的參與，其中最有效的促血管生長因子是VEGF-A［20］。VEGF-A 是VEGF的主要亞型，在低氧和炎癥因子刺激下分泌增多，與其受體VEGFR2 結合形成二聚體，從而導致胞內(nèi)酪氨酸殘基結構域磷酸化，適配器蛋白的募集和信號通路的啟動可導致內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，促進血管生成。血管生成在腫瘤的發(fā)生和轉移研究中較為深入［21］，在腎臟血管生成及腎臟疾病進展中的作用也得到關注［22-23］。異常血管新生信號激活介導的血管新生稱為病理性血管新生，新生的血管排列較正常血管紊亂，導致腎臟結構改變，加重腎間質(zhì)纖維化形成。在單側腎臟損傷后，對側腎臟失代償除了細胞增殖、焦亡等改變外，與血管的病理性新生有著密切關系，抑制血管新生可能減輕UUO 大鼠對側腎臟的損傷。

包括ON 在內(nèi)的多種慢性腎臟疾病均表現(xiàn)有不同程度的MR 活化，故抑制其活化可以減緩疾病進展［12］。醛固酮激活MR 誘導血管新生可以通過不同的途徑：（1）誘導炎癥介質(zhì)分泌如TNF-α 和IL-1β 刺激血管新生。TNF-α 可以刺激細胞內(nèi)VEGFR2 的表達，參與內(nèi)皮細胞增殖，促進血管新生［24］。（2）介導水鈉潴留導致低氧刺激血管新生。主用通過鈉/氯離子協(xié)同轉運蛋白（Na+/Cl-cotransporter，NCC）發(fā)揮作用，NCC 過表達及磷酸化可導致水鈉潴留，引起并加重組織水腫、缺血缺氧，上調(diào)低氧誘導因子的表達，刺激VEGF-A 分泌［25］。（3）上調(diào)促纖維化因子如TGF-β1 和CTGF 的表達刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管形成等。多種機制相互作用，而其關鍵在于MR的活化，在醛固酮分泌增多時，與MR結合，使生理狀態(tài)下與熱休克蛋白結合而共存在細胞胞質(zhì)中的MR 分離入核，繼而激活核轉錄因子，啟動促炎、促纖維化因子的表達，參與臟器纖維化形成。

MR 阻斷劑如螺內(nèi)酯、依普利酮、esaxerenone 等廣泛應用于高血壓、腎臟病等，通過抗炎、抗氧化等作用減輕病理損傷，減少患者尿蛋白排泄，抑制左心室肥大，降低腦血漿利鈉肽水平［26-29］。依普利酮可以減輕UUO 大鼠對側腎臟細胞增殖和焦亡，減輕腎臟損傷。本實驗觀察到，對UUO 大鼠長期給予依普利酮治療，可以抑制對側腎臟血管新生，減輕纖維化改變，其作用與下調(diào)VEGF-A的表達相關。

UUO 大鼠對側腎臟損傷也可能被考慮為對側腎臟的代償或者高濾過所致。我們在實驗過程中，切除一側腎臟，180 d后觀察腎功能及殘留腎臟病理改變，腎功能較sham 組稍有升高，腎臟病理改變不明顯，說明UUO 大鼠對側腎臟的損傷與梗阻側腎臟分泌的促炎、促纖維化介質(zhì)關系密切。

本研究結果表明，MR 阻斷劑依普利酮可通過下調(diào)VEGF-A、SGK-1 和TGF-β1 等表達抑制UUO 大鼠對側腎臟病理性血管新生，延緩腎臟纖維化的進程，為臨床的預防和治療提供了參考資料。