葛根素通過抑制小膠質細胞TLR4/NF-κB介導的炎癥反應治療神經根性疼痛*

陳 璐，朱麗蓉，蔣 珊，梁雨航，謝 彥，歐陽文瑞，鐘 祎△

（廣州醫(yī)科大學 1南山學院，2基礎醫(yī)學院，廣東廣州 511436）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是臨床常見疾病，也是神經根性疼痛的主要病因，主要表現(xiàn)為腰疼和放射性腿疼，以及腿麻無力、腰部僵硬和活動受限，嚴重者引起馬尾神經受壓、大小便失禁［1］。長期慢性疼痛嚴重影響患者的身心健康和工作生活，并給患者帶來不同程度的經濟、心理負擔。因此深入研究神經根性疼痛產生的原因和機制，具有重要的臨床意義。

葛根素（puerarin，PU）是植物葛根中提取的一種藥物，廣泛應用于高血壓、冠心病和心肌梗死等心血管疾病。近年來的研究發(fā)現(xiàn)葛根素對神經損傷和糖尿病引起的慢性疼痛有治療作用［2-4］，我們課題組發(fā)現(xiàn)葛根素可通過抑制脊髓膠質細胞的激活治療神經根性疼痛［5］，具體哪些重要的信號分子參與其中還需深入研究。

Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）是一種跨膜信號分子，參與天然免疫反應。TLR4 與其內源性或者外源性配體結合后，可通過激活NF-κB或p38信號通路引起致炎細胞因子的大量釋放［6-7］。研究表明TLR4 參與了神經損傷以及化療藥物引起的痛覺過敏［8-9］，在中樞神經系統(tǒng)，TLR4 主要表達在小膠質細胞上［10］，因此我們推測葛根素可能通過抑制TLR4及其下游信號分子，抑制小膠質細胞的激活和炎癥因子的釋放治療神經根性疼痛，本研究將從該假設出發(fā)，探究葛根素抑制脊髓膠質細胞激活治療神經根性疼痛的分子機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 成年雄性SD大鼠，體重200～250 g，購于廣東省實驗動物中心，統(tǒng)一規(guī)范飼養(yǎng)在廣州醫(yī)科大學實驗動物中心（合格證號：No.44002100 020691；No.44002100 021111；No.44005800010307）。所有動物實驗依據國際疼痛研究協(xié)會的指導方針［11］，并獲得廣州醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準。48只大鼠隨機分為4 組：假手術（sham）組、自體髓核（nucleus pulposus，NP）移植模型組（NP 組）、葛根素治療組（NP+PU組）和溶劑［生理鹽水（normal saline，NS）］對照組（NP+NS組）。治療組于造模前1 h開始腹腔注射葛根素（100 mg/kg），連續(xù)給藥7 天，溶劑對照組給與相同劑量的生理鹽水。

1.2 主要試劑 葛根素注射液（麥克林生化科技有限公司）；多聚甲醛和Triton X-100 購于Sigma-Al?drich；ELISA 試劑盒購于博士德生物技術有限公司；小鼠抗TLR4 抗體（Santa Cruz）；兔抗p-p65 抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗GAPDH 抗體（博士德）；小鼠小膠質細胞特異性Iba-1 抗體（Abcam）；HRP 偶聯(lián)IgG（Abcam）；FITC偶聯(lián)的IgG（博士德）。

2 方法

2.1 腰椎間盤突出癥模型的建立 采用大鼠自體髓核移植方法復制腰椎間盤突出癥模型［12-13］。戊巴比妥鈉麻醉后，從L4～L5 節(jié)段行半椎板切除術，暴露L5 神經根，大鼠改仰臥位，從尾椎取出NP（約5 mg）輕置于暴露的L5 神經根上，避免壓迫。逐層縫合肌肉和皮膚。假手術組大鼠行同樣的手術操作，但NP不移植到神經根上。

2.2 機械性痛閾和熱痛閾的檢測 用經典的updown 方法檢測后肢機械性撤足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）［14］。von Frey filaments（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51 和15.14 g）垂直作用于足底6～8 s，如果大鼠出現(xiàn)迅速的撤足或者舔舐足部，視為陽性反應。從2.04 g 強度開始測試，如果出現(xiàn)陰性反應，則用相鄰的更強的刺激強度，如果出現(xiàn)陽性反應，則用相鄰的更弱的刺激強度。

用熱平板（7370，UgoBasile）方法檢測后肢熱撤足潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）［15］。將熱源置于大鼠足底，如果大鼠出現(xiàn)迅速的撤足或者舔舐足部，視為陽性反應。同一只動物，同樣溫度下，取3次PWL 的平均值作為結果。術前3 d，每天檢測PWT 和PWL 作為基礎值對照，行為測試的實驗者不清楚大鼠的分組情況。

2.3 Western blot 實驗 麻醉后，取出大鼠L4～L5 節(jié)段脊髓組織，迅速置于液氮中，隨后分離脊髓背角，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的Tris 緩沖液（15 mmol/L，pH 7.6）中，冰上勻漿并超聲破碎。隨后低溫離心（14 000×g，20 min），取上清液分裝凍存于-80℃。BCA 法檢測標本蛋白濃度，SDS-PAGE 分離蛋白，并轉印到PVDF 膜（Bio-Rad）上。PVDF 膜在室溫封閉1 h 后，加入抗TLR4 或p-p65 或GAPDH 的抗體4℃孵育過夜。洗滌后加入HRP 偶聯(lián)的IgG 常溫孵育1 h，再次洗滌后用超敏ECL 試劑（Pierce）檢測免疫復合物。計算機輔助成像分析系統(tǒng)（KON?TRON IBAS 2.0）計算條帶灰度值。

2.4 免疫熒光染色 大鼠經心臟灌注生理鹽水沖去血液，再用4℃的4%多聚甲醛溶液（溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH 7.4）灌注固定。取出L4～L5 脊髓組織，繼續(xù)后固定1～3 h，隨后轉入30%蔗糖溶液脫水2 d。用冰凍切片機（Leica CM1900）將組織切成20 μm 薄片用于染色。組織片用含3%驢血清的0.3%Triton X-100 溶液常溫固定1 h，再孵育小膠質細胞特異性標記物Iba-1 抗體4℃過夜，洗滌后常溫避光孵育FITC 偶聯(lián)的IgG，用熒光顯微鏡和CCD 掃描相機（Leica）拍照。

2.5 ELISA 實驗 取L4～L5 脊髓組織，用PBS 溶液勻漿并低溫離心取上清液，根據ELISA 說明書，在預包被抗體的96 孔板中，先后加入組織上清液反應1.5 h，生物素標記抗體進行反應1 h。PBS 洗去未結合的物質，隨后加入親和素-過氧化物酶復合物反應0.5 h，再次洗滌并依次加入TMB顯色液和TMB終止液。450 nm 波長下檢測樣本吸光度并制作標準曲線做參照。根據標準曲線計算組織中白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tu?mor necrosis factor α，TNF-α）和IL-10蛋白的含量。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，并用SPSS 13.0 軟件分析。Western blot、免疫熒光和ELISA 數(shù)據用單因素方差分析加Turkey 檢驗進行統(tǒng)計，行為學測試數(shù)據用非配對t檢驗進行統(tǒng)計。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 葛根素顯著增加NP移植大鼠機械性撤足閾值和熱撤足潛伏期

NP 移植后大鼠同側后肢PWT 和熱撤足潛伏期PWL 顯著降低（P＜0.05），持續(xù)到術后20 d。從術前1 h 開始，連續(xù)7 d 腹腔注射葛根素注射液顯著增加后肢PWT 和PWL（P＜0.05），見圖1。表明葛根素可提高NP 大鼠痛覺閾值，緩解機械性痛覺過敏和熱痛覺超敏。

Figure 1.Puerarin（PU）increased PWT and PWL of the rats with NP implantation.Compared with sham group，PWT and PWL were decreased in the rats with NP implantation，lasting to 20 d after operation.Meanwhile，PWT and PWL were increased by successively intraperitoneal injection of PU（100 mg·kg-1·d-1）for 7 d in the rats with NP implantation.Mean±SEM. n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs NP+NS group.圖1 葛根素增加NP組大鼠機械性撤足閾值和熱撤足潛伏期

2 葛根素顯著降低NP 移植大鼠脊髓組織中TLR4和p-p65的蛋白水平

葛根素給藥持續(xù)7 d，術后14 d 取脊髓組織，用Western blot 方法檢查TLR4 和p-p65 的蛋白水平，與sham 組相比，NP組大鼠脊髓TLR4和p-p65的蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與溶劑對照組相比，葛根素顯著降低TLR4和p-p65的蛋白水平（P＜0.05），見圖2。

3 葛根素顯著抑制NP移植大鼠脊髓背角小膠質細胞激活

由于中樞神經系統(tǒng)中TLR4主要表達在小膠質細胞，我們推斷葛根素可以通過抑制TLR4抑制小膠質細胞激活。免疫熒光染色方法檢測小膠質細胞特異性標記物Iba-1 的表達，并觀察小膠質細胞形態(tài)。與sham組相比，NP組大鼠脊髓背角Iba-1陽性面積顯著增加（P＜0.01），高倍鏡下觀察不同組大鼠脊髓背角小膠質細胞形態(tài)，與sham組相比，NP組小膠質細胞胞體肥大，突起增加，呈典型的阿米巴樣形態(tài)，表明NP 組大鼠脊髓小膠質細胞明顯激活。與溶劑對照組相比，PU顯著降低Iba-1陽性面積（P＜0.01），見圖3。

4 葛根素顯著抑制NP移植大鼠脊髓背角炎癥反應

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的免疫細胞，激活后常引起神經炎癥反應。我們用ELISA 試劑盒檢測脊髓組織中致炎細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 抗炎細胞因子IL-10 的蛋白含量。與sham 組相比，NP 組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著升高（P＜0.01），IL-10 的含量顯著降低（P＜0.01）；與溶劑對照組相比，葛根素顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α表達（P＜0.05），并增加IL-10 的表達（P＜0.05），見圖4。這提示葛根素顯著抑制NP 移植引起的神經炎癥反應。

Figure 2.Puerarin（PU）decreased spinal protein levels of TLR4 and p-p65.Spinal protein levels of TLR4 and p-p65 in different groups were detected by Western blot.The protein level of TLR4 and p-p65 were significantly increased in the rats with NP as compared with sham group，and were decreased by successively intraperitoneal injection of PU（100 mg·kg-1·d-1）for 7 d.Mean±SEM. n=4.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs NP+NS group.圖2 葛根素降低NP組大鼠脊髓背角TLR4和p-p65的蛋白水平

Figure 3.Puerarin（PU）inhibited microglia activation in spinal dorsal horn of the rats with NP implantation.A―D：the expression of microglia marker Iba-1 in spinal dorsal horn of different groups（scale bar=200 μm）；E―H：the morphology of microglia in high magnification（scale bar=50 μm），microglia in NP rats showed cell body hypertrophy，and thickened and retracted processes；I：the bar chart showed the positive area of Iba-1 in spinal dorsal horn of different groups.Mean±SEM. n=4.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs NP+NS group.圖3 葛根素顯著抑制NP組大鼠脊髓背角小膠質細胞的激活

討論

Figure 4.Puerarin（PU）inhibited neuroinflammatory responses of the rats with NP implantation.Compared with sham group，the protein levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α were increased，and the protein level of IL-10 was decreased in NP group，while PU significantly decreased the protein levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α，and increased the protein level of IL-10 in the rats with NP implantation.Mean±SEM. n=4.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs NP+NS group.圖4 葛根素顯著抑制NP組大鼠脊髓神經炎癥反應

腰椎間盤突出癥常引起單側的、沿坐骨神經走向放射的下腰部疼痛，臨床也稱為神經根性疼痛。LDH 患者的疼痛絕大多數(shù)屬于慢性疼痛（疼痛持續(xù)超過3 個月），甚至有10%的病人手術摘除病變椎間盤后還出現(xiàn)長期的神經根性疼痛癥狀［16］，深入研究神經根性疼痛產生的機制具有重要臨床意義。正常的椎間盤組織由中央的髓核和外周的纖維環(huán)組成，NP 是人體最大的無血供組織，當纖維環(huán)破裂，NP 膨出接觸到神經根，則引起疼痛癥狀。曾經很長一段時間，大家認為NP 對神經根的機械壓迫是疼痛產生的最主要原因，但是臨床研究發(fā)現(xiàn)壓迫程度和疼痛的嚴重程度并不相關，其他的機制比如神經炎癥可能參與了神經根性疼痛的發(fā)展［17-18］。

葛根素是從天然植物葛根中提取的一種C-糖基化大豆異黃酮，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用［2-4］，廣泛用于治療心血管系統(tǒng)疾病。近年的研究發(fā)現(xiàn)葛根素對神經損傷和糖尿病引起的慢性疼痛有治療作用［19-20］。葛根素可保護神經元免受氧化應激損傷［21］，我們課題組也報道了腹腔注射葛根素可抑制脊髓膠質細胞的活化和炎癥反應［5］，本研究進一步發(fā)現(xiàn)葛根素可能通過抑制TLR4/NF-κB 通路治療神經根性疼痛。

TLR4 是一種跨膜信號分子，參與天然免疫反應。TLR4 與其內源性或者外源性配體結合后，可通過激活NF-κB 或p38 信號通路引起致炎細胞因子的大量釋放［6-7］。本研究發(fā)現(xiàn)NP移植后，同側后肢出現(xiàn)明顯的機械性和熱痛閾下降，持續(xù)到術后20 d，同時脊髓背角TLR4 和p-p65 的蛋白水平顯著增加，與溶劑對照組相比，連續(xù)7 d 腹腔注射葛根素（100mg/kg）顯著提高機械性和熱痛閾，并降低TLR4 和p-p65 的蛋白水平。在中樞神經系統(tǒng)，TLR4 主要表達在小膠質細胞上［10］。小膠質細胞是神經系統(tǒng)的免疫細胞，活化的小膠質細胞可通過釋放大量的致炎細胞因子，比如TNF-α 和IL-1β 等引起神經炎癥反應［22-23］。動物實驗發(fā)現(xiàn)LDH 大鼠脊髓小膠質細胞顯著活化［5，23］。臨床研究發(fā)現(xiàn)：LDH 病人腦脊液和/或血漿中致炎細胞因子表達顯著升高，抑制這些因子對治療神經根性疼痛有積極作用［24］。本研究發(fā)現(xiàn)NP 移植后脊髓背角小膠質細胞顯著激活，表現(xiàn)為特異性細胞標記物Iba-1 熒光陽性面積增加，高倍鏡下可看到小膠質細胞胞體肥大，突起增加，呈典型阿米巴樣改變，葛根素顯著抑制脊髓背角小膠質細胞活化，同時抑制脊髓神經炎癥反應，具體表現(xiàn)為降低脊髓組織致炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，增加抗炎細胞因子IL-10的含量。

綜上所述，葛根素可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路，抑制脊髓小膠質細胞活化和神經炎癥反應，治療LDH誘導的神經根性疼痛。