華蟾毒它靈通過線粒體途徑引起肝癌細(xì)胞凋亡*

潘 越，胡思宏，王佳鑫，李柯金，張亞霖，余詩佳，劉紅亮△，鮑登克△，楊虎山△

（1河南大學(xué)藥學(xué)院腫瘤標(biāo)志物與液體活檢實驗室，河南開封 475004；2信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南信陽 464000）

肝癌一種高侵襲性、高致死率、預(yù)后差的惡性腫瘤，近年來肝癌的發(fā)病率和病死率逐年上升。手術(shù)切除是肝癌目前最佳的治療方式，但是肝癌病人往往因為早期癥狀不明顯，不能被及時診斷出來，所以肝癌的早期診斷率很低，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)到了晚期，已經(jīng)失去了手術(shù)治療的最佳時機(jī)［1］。肝癌的發(fā)生進(jìn)展受很多因素的影響，其發(fā)病機(jī)制還沒有完全弄清楚。越來越多的研究表明，肝癌的的進(jìn)展主要由基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異?；罨榷喾N因素造成［2］。近年來，中藥在腫瘤治療中展現(xiàn)了較好的臨床效果，在提高機(jī)體免疫力、減輕放化療副作用，及抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面受到了廣泛關(guān)注，中藥可顯著提高患者的生存期［3］。華蟾毒它靈是我國傳統(tǒng)動物藥材蟾酥的毒性配基之一，是從蟾蜍科動物如中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺和皮膚的分泌物中提取分離的［4-6］。目前臨床上用于治療肝癌和胃癌等腫瘤的藥物華蟾素注射液的有效成分之一是華蟾毒它靈，它還可用作強(qiáng)心劑、利尿劑和止血劑［7］。華蟾素注射液聯(lián)合肝動脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial che?moembolization，TACE）輔助治療晚期肝癌時，可顯著提高TACE 治療效果，減輕TACE 對肝功能的損害程度［8］。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系SNU-739 購自南京科佰生物科技有限公司，由本實驗室保存。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，選取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于實驗。

1.2 實驗動物 本實驗所用的SPF 級雌性BALB/c裸鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（合格證號：No.1100112011000586）。實驗動物的飼養(yǎng)條件符合SPF 級動物室要求，室內(nèi)溫度21～24℃，空氣相對濕度50%～70%，晝夜節(jié)律用日光燈控制，每天光照時間12 h（早7 點(diǎn)～晚7 點(diǎn)）。飲用水為高壓滅菌水，使用飼料為SPF 級動物專用飼料。自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)籠墊料使用SPF 級動物專用墊料，每周更換2次。

1.3 藥品及試劑 華蟾毒它靈（美侖生物公司）；胰蛋白酶、BCA 蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色試劑盒、結(jié)晶紫、多聚甲醛和MTT 試劑（北京索萊寶科技有限公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydroge?nase，LDH)試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒和RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒、DAPI 和AnnexinV-FITC 試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（US Everbright?Inc.）；ATP 試劑盒（Pro?mega）；抗Bax 和Bcl-2 抗體（Proteintech）；抗NF-κB p65和NF-κB p-p65抗體（Cell Signaling Technology）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Corning）；新生胎牛血清（Biologi?cal Industries）；磷酸酶和蛋白酶抑制劑（Roche）；蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific-CN）；RNA 提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；引物由上海Sangon生物制品公司合成。

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和MTT 法檢測細(xì)胞活力 對數(shù)生長的SNU-739 細(xì)胞以1×108/L 接種于96 孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞生長到80%左右狀態(tài)時進(jìn)行實驗。每孔加入100 μL 不同濃度的華蟾毒它靈（50、100、200、300、400、500 和1 000 nmol/L），另外設(shè)置空白對照組，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后加入10 μL MTT（5×10-3mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入110 μL DMSO，在搖床上振蕩至充分溶解，再在酶標(biāo)儀490 nm 波長處測各孔的A值，實驗重復(fù)3次。按照以下公式計算細(xì)胞活力抑制率，細(xì)胞活力抑制率（%）=［1-（實驗組A）/（對照組A）］×100%，半數(shù)抑制濃度（inhibitory con?centration 50，IC50）值由軟件求出。同時，在倒置顯微鏡下觀察華蟾毒它靈作用48 h 后的肝癌細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2 LDH 細(xì)胞毒性檢測法檢測華蟾毒它靈的細(xì)胞毒性 對數(shù)生長的SNU-739 細(xì)胞以1×108/L 接種于96孔板中，每孔100 μL，在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度的華蟾毒它靈（0、150、300 和600 nmol/L），另外設(shè)置空白對照組，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用移液槍取上清液60 μL到新的孔中，加入已經(jīng)配置好的30 μL 的LDH 檢測工作液，混勻，在室溫下避光孵育30 min，490 nm 處測定A值。

2.3 集落形成實驗檢測SNU-739 細(xì)胞的增殖 對數(shù)生長的SNU-739 細(xì)胞以5×108/L 接種于6 孔板中，每孔2 mL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度（0、150、300 和600 nmol/L）的華蟾毒它靈，另外設(shè)置空白對照組，每隔4 d 換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)鏡下能觀察到約40 個集落時停止培養(yǎng)。然后用PBS清洗3次，多聚甲醛固定40 min后再用結(jié)晶紫染色30 min，拍照計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.4 EdU 細(xì)胞增殖實驗檢測SNU-739 細(xì)胞增殖 對數(shù)生長的SNU-739 細(xì)胞以1×108/L 接種于96 孔板中，每孔100 μL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度的（0、150、300 和600 nmol/L）華蟾毒它靈，另外設(shè)置空白對照組，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)。根據(jù)EDU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞固定化、EDU 反應(yīng)、染色等步驟。再在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

2.5 DAPI 染色觀察SNU-739 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 將藥物處理后的SNU-739 細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后終止培養(yǎng)，用PBS 清洗3 次，然后用4%多聚甲醛固定5 min，稀釋DAPI 染液使其終濃度為50 μmol/L，每孔100 μL，室溫避光染色20 min，在PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.6 TUNEL 染色檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的SNU-739 細(xì)胞以1×108/L 接種于96 孔板中，每孔100 μL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同濃度的華蟾毒它靈（0、150、300和600 nmol/L）。另設(shè)空白組，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS 清洗2 次，加入100 μL TUNEL 平衡緩沖液，常溫孵育5 min 后，最后加入50 μL 反應(yīng)緩沖液，避光孵育60 min，用離心機(jī)離心棄掉上清液，加入5×10-3mg/L BSA 清洗，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測SNU-739 細(xì)胞的凋亡率 收集對數(shù)生長期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞至3×108/L接種于6孔板中，每孔2 mL 細(xì)胞液，待細(xì)胞貼壁，各組細(xì)胞分別加入不同濃度的（0，150，300 和600 nmol/L）華蟾毒它靈并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，采用Annexin V/PI 染色后1 h 內(nèi)每組收集固定10 000 個細(xì)胞進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞凋亡率。每組樣品重復(fù)做3次。

2.8 RT-qPCR 檢測肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax 的mRNA 水平 肝癌細(xì)胞SNU-739 經(jīng)藥物處理后，用Trizol 法提取總RNA，然后用Prime Script RT-PCR 試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。Bax 的上游引物序列為5'-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3'，下游引物序列為5'-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3'；Bcl-2 的上游引物為5'-GTGGATGACTGAGTACCT?GAACC-3'，下游引物序列為5'-AGACAGCCAG?GAGAAATCAAAC-3'；GAPDH 的上游引物為5'-CC?GTGACAATTACCTGGCCTTC-3'，下游引物序列為5'-CAGGGCCTTCAGCTGGTTTC-3'。20 μL 反應(yīng)體系組成：SYBR FAST qPCR Mix（2×）10 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、cD?NA 模版2 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃15 s，60℃1 min，40 個循環(huán)。最后運(yùn)用2-ΔΔCt法分析各基因的相對表達(dá)情況［9］。

2.9 Western blot 法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的蛋白水平 收集對數(shù)生長期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞至3×108/L接種于6 孔板中，每孔2 mL 細(xì)胞液。細(xì)胞經(jīng)藥物處理48 h后，用含有1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液，裂解細(xì)胞收集細(xì)胞總蛋白，用BCA 測定試劑盒測定各組蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、4℃過夜孵育Ⅰ抗后，再用TBST 洗膜10 min、3 次，室溫孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgGⅡ抗（1∶5 000）1 h，TBST洗膜10 min、3 次，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影并觀察拍照。

2.10 JC-1 熒光探針檢測線粒體膜電位 細(xì)胞經(jīng)華蟾毒它靈作用48 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，每孔加入1 mL JC-1 染色工作液，37℃孵育20 min，PBS洗滌2次后，熒光顯微鏡下觀察。

2.11 ATP 生成的檢測 細(xì)胞經(jīng)華蟾毒它靈作用48 h 后棄去培養(yǎng)基，加入CellTiter-Glo 試劑，室溫孵育10 min，使用酶標(biāo)儀檢測熒光信號。

2.12 裸鼠皮下成瘤實驗檢測華蟾毒它靈對SNU-739 細(xì)胞體內(nèi)增殖的抑制作用 將4 周齡雌性BALB/c裸鼠，隨機(jī)分成DMSO對照組和給藥組，每組5 只。每只裸鼠右側(cè)肩胛骨皮下接種6×106個SNU-739 細(xì)胞，接種1 周后，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑和最短徑，待小鼠瘤體直徑長至2～3 mm 時，向腫瘤內(nèi)注射華蟾毒它靈（對照組注射DMSO）2 mg/kg，每周2 次。注射4 周后使用脫臼法處死小鼠，取出腫瘤塊，稱重，拍照，繪制成瘤生長曲線。

2.13 免疫組化法檢測腫瘤組織ki67 的表達(dá)用商品化免疫組織化學(xué)試劑盒，按照步驟進(jìn)行石蠟組織切片脫蠟，水化，抗原修復(fù)，封閉，Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育，DAB 顯色、蘇木精復(fù)染等操作流程檢測ki67表達(dá)情況。每次均設(shè)有陽性對照及陰性對照。每個染色樣品選5 個不同高倍視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞，采用雙盲法進(jìn)行閱片，對蛋白染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分，綜合二者評分分析檢測ki67 在肝癌組織中的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，均數(shù)間比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 華蟾毒它靈抑制SNU-739細(xì)胞的增殖能力

MTT 實驗結(jié)果表明，華蟾毒它靈能顯著抑制肝癌SNU-739 細(xì)胞的活力，并有明顯的藥物劑量依賴性，IC50為300 nmol/L（圖1A）。同時LDH 檢測結(jié)果也顯示，藥物作用濃度與細(xì)胞釋放的LDH 含量呈正比（圖1B）。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常組細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)規(guī)則，華蟾毒它靈給藥組均看到不同程度的細(xì)胞死亡（圖1C）。我們通過集落形成實驗和EdU 實驗研究了華蟾毒它靈對肝癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1D 所示，華蟾毒它靈能夠明顯抑制SNU-739 細(xì)胞的集落形成，并具有一定的劑量依賴性；EdU 實驗表明，華蟾毒它靈作用后SNU-739 細(xì)胞的染料摻入百分比明顯低于對照組，隨著藥物濃度的增加，EdU染料摻入細(xì)胞的百分比越低（圖1E）。上述結(jié)果表明，華蟾毒它靈能夠明顯抑制SNU-739 細(xì)胞的體外增殖能力。

2 華蟾毒它靈誘導(dǎo)肝癌SNU-739細(xì)胞凋亡

DAPI 染色結(jié)果表明，華蟾毒它靈作用后，SNU-739 細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)為濃縮、碎裂、染色加深的大小不等的圓形小體，核膜聚集于一邊（圖2A）。TU?NEL 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著華蟾毒它靈藥物濃度的增大，綠色熒光陽性細(xì)胞比例逐漸越多，表明細(xì)胞凋亡比例逐漸增加（圖2B）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也表明，華蟾毒它靈作用后可顯著促進(jìn)SNU-739 細(xì)胞的凋亡（圖2C）。

3 華蟾毒它靈通過線粒體相關(guān)途徑誘導(dǎo)肝癌SNU-739細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步研究華蟾毒它靈誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們首先使用JC-1 熒光探針檢測華蟾毒它靈對肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響。結(jié)果顯示，華蟾毒它靈作用后不僅細(xì)胞密度下降明顯，而且較多的細(xì)胞被染上綠色熒光，表明細(xì)胞的線粒體膜電位下降（圖3A）。同時，ATP 檢測發(fā)現(xiàn)華蟾毒它靈作用后，SNU-739細(xì)胞的ATP 生成也顯著減少（圖3B），表明，華蟾毒它靈作用后，SNU-739 的線粒體功能明顯受到影響。最后，我們檢測了華蟾毒它靈對肝癌細(xì)胞中線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵分子Bax和Bcl-2表達(dá)水平的影響，以及對NF-κB 信號途徑活化情況的影響。Western blot 和RT-qPCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，華蟾毒它靈作用后促凋亡相關(guān)分子Bax 的表達(dá)水平顯著升高，而凋亡抑制相關(guān)分子Bcl-2 的表達(dá)水平下降（圖3C）。同時，華蟾毒它靈作用后p65 磷酸化水平顯著減少，而p65 的總體水平并無顯著變化（圖3D）。以上結(jié)果表明，華蟾毒它靈可能通過抑制線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

4 華蟾毒它靈抑制肝癌SNU-739體內(nèi)增殖

為了進(jìn)一步研究華蟾毒它靈對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的抑制效果，我們研究了其對SNU-739 細(xì)胞裸鼠皮下成瘤的影響。如圖4 所示，與對照組相比，華蟾毒它靈給藥后的腫瘤體積和重量均明顯下降。同時，華蟾毒它靈給藥后核增殖抗原Ki-67的表達(dá)也顯著降低。以上結(jié)果表明，華蟾毒它靈可以抑制肝癌細(xì)胞SNU-739細(xì)胞的體內(nèi)成瘤及增殖。

討論

肝癌是一種高侵襲性、高致死率、預(yù)后差的惡性腫瘤，近年來肝癌的發(fā)病率和病死率逐年上升，手術(shù)切除是肝癌目前最佳的治療方式［1］。近年來，中藥在腫瘤治療中的潛能受到了廣泛的關(guān)注，展現(xiàn)出一定的臨床優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在提高患者術(shù)后免疫力、減輕患者放化療副作用、腫瘤復(fù)發(fā)抑制和減少轉(zhuǎn)移等方面。比如，冬凌草甲素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞在G2/M期，抑制食管癌細(xì)胞的增殖，并通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的表達(dá)從而抑制食管癌細(xì)胞的遷移。一些中藥可顯著抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，如復(fù)方苦參注射液可以有效的抑制結(jié)腸癌、腦癌和乳腺癌的轉(zhuǎn)移［10］，中藥人參皂苷可以抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［11］。雷公藤甲素可以顯著抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞體外增殖，其機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯于S 期和影響細(xì)胞周期因子cyclin B1 的表達(dá)和改變P34 磷酸化有關(guān)。前期研究表明，細(xì)胞凋亡與線粒體功能密切相關(guān)，凋亡細(xì)胞的線粒體膜電位下降，ATP 生成減少［12-13］。

Figure 1.Cinobufotalin inhibited the proliferation of SNU-739 cells.A：MTT assay was performed to assess the viability in SNU-739 cells treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h；B：the effects of cinobufotalin at different concentrations on the release of LDH from SNU-739 cells were detected by LDH assay；C：cell morphology were observed in SNU-739 cells treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h（scale bar=10 μm）；D：colony-forming ability of SNU-739 cells was detected after incubated with different concentrations of cinobufotalin（scale bar=10 mm）；E：EdU adultera?tion method was used to detect the proliferation capacity of SNU-739 cells after 48 h action of cinobufotalin at different con?centrations（scale bar=10 μm）.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs 0 nmol/L group.圖1 華蟾毒它靈抑制SNU-739細(xì)胞活力和增殖能力

Figure 2.Cinobufotalin induced apoptosis of SNU-739 cells.After treatment with different concentrations of cinobufotalin for 48 h，the apoptosis of SNU-739 cells was detected by DAPI staining（A），TUNEL staining（B）and flow cytometry with Annexin V/PI staining（C）.The scale bar=10 μm.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 nmol/L group.圖2 華蟾毒它靈誘導(dǎo)肝癌SNU-739細(xì)胞凋亡

然而，華蟾毒它靈雖可通過抑制肝癌細(xì)胞增殖用于肝癌治療，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本實驗通過體內(nèi)外檢測方法充分證明華蟾毒它靈可顯著抑制肝癌細(xì)胞SNU-739 的增殖。MTT 實驗發(fā)現(xiàn)，華蟾毒它靈藥物濃度越高，對SNU-739 細(xì)胞生長的抑制效果越強(qiáng)；LDH 檢測結(jié)果也顯示，華蟾毒它靈作用濃度與SNU-739 細(xì)胞釋放的LDH 含量呈正比；集落形成實驗和EdU 實驗都進(jìn)一步證實了華蟾毒它靈可顯著抑制肝癌細(xì)胞SNU-739 的增殖。同時，我們還在裸鼠皮下移植瘤模型中證明了華蟾毒它靈也可在體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的進(jìn)展。有大量研究表明，藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在抗腫瘤研究中扮演著重要的角色［14］。抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax同屬于Bcl-2基因家族，與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時促凋亡基因Bax與抑凋亡基因Bcl-2的比值增大［15］。有研究表明，華蟾毒它靈通過上調(diào)Bid、Bax、cytochrome-C、caspase-2/-3/-8/-9 及Fas受體的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)源性和外源性凋亡通路。華蟾毒它靈是否也可通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤效果尚不清楚。本實驗中流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL和DAPI 染色結(jié)果都證明華蟾毒它靈可誘導(dǎo)SNU-739 細(xì)胞凋亡。同時，華蟾毒它靈處理組Bax 的mRNA 和蛋白表達(dá)均上調(diào)，而Bcl-2 的表達(dá)下調(diào)。前期有研究表明，Bcl-2 家族蛋白是線粒體膜上調(diào)控細(xì)胞凋亡的一類蛋白，該蛋白的結(jié)合狀態(tài)將調(diào)節(jié)線粒體膜電位的變化，同時伴隨著ATP 的變化［13］。Li等［16］發(fā)現(xiàn)中藥花椒的提取物可破壞腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位，誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。我們的研究結(jié)果也證實了華蟾毒它靈處理組細(xì)胞的線粒體膜電位下降，呈濃度依賴性，同時華蟾毒它靈作用下ATP 生成量也減少。本實驗也發(fā)現(xiàn)了華蟾毒它靈對細(xì)胞p-p65 有濃度依賴性的下調(diào)，對總p65 水平?jīng)]有影響，這說明華蟾毒它靈可能通過NF-κB 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制肝癌SNU-739 細(xì)胞的增殖，為我們后續(xù)實驗提供了明確的思路。

Figure 3.Apoptosis induced by cinobufotalin was related to mitochondrial function.A：mitochondrial membrane potential were inves?tigated in SNU-739 cells using the JC-1 probe（indicated by ratio of red to green fluorescence）；B：ATP synthesis level in SNU-739 cells；C：RT-qPCR analyses were performed to detect the mRNA expression changes of Bax and Bcl-2 in SNU-739 cells after treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h；D：Western blot analysis was performed to de?tect the protein expression changes of Bax，Bcl-2，p65 and p-p65（Ser536）in SNU-739 cells after treated with different concentrations of cinobufotalin for 48 h.The scale bar=10 μm.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 nmol/L group.圖3 華蟾毒它靈誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡與線粒體功能相關(guān)

Figure 4.Cinobufotalin inhibited proliferation of SNU-739 cells in vivo.A：mice were sacrificed 4 weeks after the indicated treat?ments，and the tumor weight and tumor volume were measured；B：immunohistochemical staining for Ki67 in the tumors of each group and the percentage of Ki-67 positive cells（scale bar=10 μm）.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group.圖4 華蟾毒它靈抑制體內(nèi)肝癌SNU-739細(xì)胞移植瘤增殖

綜上所述，本研究表明，華蟾毒它靈可以在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞株SNU-739 細(xì)胞的增殖，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax 的表達(dá)，下調(diào)NF-κB p65 的磷酸化水平，使線粒體膜電位下降、ATP 生成減少，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。華蟾毒它靈對肝癌細(xì)胞具有良好的抗腫瘤作用，進(jìn)一步研究其在肝癌等惡性腫瘤中的作用及分子機(jī)制，將為華蟾毒它靈在臨床腫瘤治療的應(yīng)用上提供更加可靠的依據(jù)。華蟾毒它靈誘發(fā)肝癌細(xì)胞線粒體途徑的凋亡，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實。通過哪些信號通路發(fā)揮作用？如何影響線粒體的功能？均有待進(jìn)一步探討。