淫羊藿苷通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大損傷*

周 琳，羅 娟，戢艷瓊，路玲俐，張秋芳，2△

（湖北醫(yī)藥學(xué)院 1藥理教研室，2武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰 442000）

心血管疾病是目前威脅公共衛(wèi)生健康的常見病之一，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和缺血性心肌病等，而心力衰竭（heart failure，HF）是各種心血管疾病的終末期階段，長(zhǎng)期腎上腺素系統(tǒng)及腎素血管緊張素系統(tǒng)緊張度增加，心室壁代償性增厚，心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)與成分出現(xiàn)改變，出現(xiàn)心肌肥大，心臟功能降低［1］。心肌肥大是心臟適應(yīng)性反應(yīng)的結(jié)果，但持續(xù)性的心肌肥大也會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞的損傷，增加細(xì)胞凋亡，使功能細(xì)胞減少，心臟功能下降。近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡與多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕心肌細(xì)胞凋亡成為抑制心肌重構(gòu)的策略之一［2］。

植物淫羊藿有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效，廣泛用于治療高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松及更年期綜合征等［3-4］，其水提物，可擴(kuò)張冠脈、降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、減輕脂質(zhì)過氧化、增加心肌細(xì)胞總抗氧能力和降低鈣離子超載，減少心肌細(xì)胞凋亡［5-7］，減少缺血心肌的的梗死面積［8］。淫羊藿苷（icariin，ICA）是從淫羊藿中提取出的一種黃酮醇苷化合物。以往本課題組研究發(fā)現(xiàn)，衣霉素可以誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞產(chǎn)生過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而ICA 預(yù)處理可以顯著改善衣霉素誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與直接抑制葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、GRP94 和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous pro?tein，CHOP），減少ROS 的產(chǎn)生有關(guān)，說(shuō)明ICA 可能通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路來(lái)降低細(xì)胞凋亡保護(hù)H9c2 細(xì)胞［9］。但I(xiàn)CA 對(duì)心肌肥大有否作用還不清楚。為此本研究擬選擇異丙腎上腺素（isoprotere?nol，ISO）誘導(dǎo)心肌H9c2 細(xì)胞肥大，建立心肌肥大損傷模型，觀察ICA 對(duì)ISO 誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的作用。以往研究顯示，ICA 對(duì)心血管的作用與其的β受體阻斷作用有關(guān)，所以本課題β 受體阻斷劑為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)一步探討其機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

材料和方法

1 材料

大鼠心肌H9c2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)自中國(guó)浙江杭州四季青生物工程材料公司；胰蛋白酶和高糖DMEM 購(gòu)自GIBCO；ICA、ISO 和4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）均購(gòu)自Sigma；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydragenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；抗GRP78 和GRP94 抗體均購(gòu)自Abcam；兔抗CHOP 抗體購(gòu)自Thermo；抗GAPDH 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d 換液，待到細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的H9c2 心肌細(xì)胞隨機(jī)分為7 組。對(duì)照（control）組加入含1%胎牛血清的正常培養(yǎng)基及相應(yīng)體積的DMSO；模型組（ISO 組）用含1%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h 后加入終濃度為10 μmol/L 的ISO，培養(yǎng)48 h；低劑量ICA 組給予含1%胎牛血清的正常培養(yǎng)基，加入終濃度為10 μmol/L 的ICA 預(yù)處理1 h 后，再給予10 μmol/L ISO+10 μmol/L ICA 處理48 h；中劑量ICA 組和高劑量ICA 組分別給予終濃度20 μmol/L 和40 μmol/L 的ICA 預(yù)處理1 h，4-PBA 組給予5 mmol/L 4-PBA 預(yù)處理1 h，美托洛爾（metoprolol，Meto）組給予5 μmol/L Meto 預(yù)處理1 h，再給予的ISO濃度及作用時(shí)間與模型組相同。

2.3 MTT 法檢測(cè)不同濃度ICA 對(duì)H9c2 細(xì)胞活力的影響 H9c2 細(xì)胞被消化后使用完全培養(yǎng)基種于96孔板中，24 h 后換1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，按分組進(jìn)行處理，處理結(jié)束后，每孔加入10 μL 5 g/L 的MTT 溶液，充分混勻后在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)作用4 h后終止培養(yǎng)，加入150 μL DMSO 溶解結(jié)晶物，在37℃恒溫?fù)u床上勻速振蕩15 min，使結(jié)晶完全溶解。在570 nm 波長(zhǎng)（630 nm 校準(zhǔn)）處檢測(cè)吸光度（A）。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（測(cè)定組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%.

2.4 細(xì)胞表面積染色 將細(xì)胞按1.5×108/L 密度種植于24 孔板中，按處理組處理結(jié)束后，4%多聚甲醛在室溫固定20 min，然后再用PBS 沖洗3 遍，用含1%BSA的PBS溶液在室溫下封閉60 min，加入終濃度為5 mg/L 的鬼筆環(huán)肽于室溫下避光染色30 min，再次用PBS 清洗3 遍；加入濃度為DAPI 室溫下避光染細(xì)胞核5 min，用PBS清洗3便；在熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞骨架微絲情況，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10 個(gè)視野，用ImageJ測(cè)定H9c2細(xì)胞表面積。

2.5 Hoechst 33258 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡［10］H9c2 細(xì)胞按分組處理結(jié)束后，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，每孔加入500 μL Hoechst 33258避光染色5 min，后用PBS洗滌3遍去除染色液，在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2.6 TUNEL 染色 按分組處理H9c2 細(xì)胞后，采用4%多聚甲醛中固定細(xì)胞，按照羅氏試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL 染色，再采用DAPI 染細(xì)胞核。采用Nikon熒光顯微鏡觀察（×200）。選擇8～10 個(gè)視野，應(yīng)用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的細(xì)胞核數(shù)目（藍(lán)色熒光）及凋亡細(xì)胞數(shù)目（綠色熒光），凋亡率即為凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞（DAPI染細(xì)胞核數(shù)）的比值。

2.7 LDH 釋放評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷程度 細(xì)胞處理結(jié)束后，按試劑盒說(shuō)明用多孔板離心機(jī)400 r/min 離心5 min，吸取上清液120 μL 到另外一個(gè)96 孔板中，加入60 μL LDH檢測(cè)液，充分混勻，避光孵育30 min；在多功能酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定A值，計(jì)算比較各組LDH的釋放量。

2.8 Western blot 檢測(cè)GRP78、GRP94 和CHOP 蛋白水平 各組處理結(jié)束后，采用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度；用10% SDS-PAGE 進(jìn)行恒壓（100 mV）分離，再用恒流轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5% 脫脂牛奶常溫封閉1 h；抗GRP78、GRP94、CHOP 及GAPDH 抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜；Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育2 h；通過ECL 顯影，采用ImageJ軟件分析灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ICA 對(duì)ISO 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞活力和LDH 釋放的影響

與對(duì)照組比較，ISO 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與ISO 組相比，10、20 和40 μmol/L ICA 使細(xì)胞活力呈濃度依賴性上升（P＜0.01），5 mmol/L 4-PBA（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑）同樣可以顯著提高細(xì)胞活力（P＜0.01），提示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以顯著提高H9c2細(xì)胞活力，減少心肌細(xì)胞壞死，見圖1A。

為了評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷程度，我們檢測(cè)了細(xì)胞上清液中LDH 釋放量。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，ISO 組細(xì)胞上清液中LDH 水平顯著升高（P＜0.01）；與ISO 組相比，10、20 和40 μmol/L ICA 預(yù)處理使得細(xì)胞上清液中LDH 水平顯著降低（P＜0.01），5 mmol/L 4-PBA及5 μmol/L Meto預(yù)處理也可顯著減少LDH 的釋放（P＜0.01），說(shuō)明ICA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑及β1受體拮抗劑均可顯著減輕ISO 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，見圖1B。

Figure 1.The effect of icariin（ICA）on H9c2 cell injury in?duced by 10 μmol/L isoproterenol（ISO）.A：MTT assay；B：LDH assay.4-PBA：4-phenylbutyric acid（5 mmol/L）；Meto：metoprolol（5 μmol/L）.Mean±SEM. n=8. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ISO group.圖1 ICA對(duì)ISO誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的作用

2 ICA對(duì)ISO誘導(dǎo)細(xì)胞肥大的影響

細(xì)胞骨架微絲用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ISO組的細(xì)胞變得肥大，骨架微絲的熒光明亮，微絲密度也有所增大，且分布不均勻，排列較紊亂，還有的微絲聚集成團(tuán)，細(xì)胞表面積也顯著增大（P＜0.01）；而與ISO 組相比，10、20 和40 μmol/L ICA 組、5 mmol/L 4-PBA 組及5 μmol/L Meto 組均可見細(xì)胞骨架微絲密度降低，排列較整齊，分布均勻，極少見高熒光強(qiáng)度的肥大細(xì)胞，細(xì)胞表面積顯著減小（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.The effect of icariin（ICA）on H9c2 cell hypertrophy induced by 10 μmol/L isoproterenol（ISO）.Images of rhodamine-la?beled phalloidin staining（red）and DAPI staining（blue）were shown（×200），and the cell surface area was quantified.4-PBA：4-phenylbutyric acid（5 mmol/L）；Meto：metoprolol（5 μmol/L）.Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ISO group.圖2 ICA對(duì)ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大的影響

3 ICA對(duì)ISO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ISO 組H9c2 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），不同濃度的ICA 均可抑制ISO 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P＜0.05 或P＜0.01），4-PBA 及Meto分別作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑及選擇性β1受體拮抗劑對(duì)ISO 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也有顯著抑制作用（P＜0.01），見圖3A；采用TUNEL 染色，ICA 降低H9c2 細(xì)胞凋亡率的結(jié)果與Hoechst 33258染色結(jié)果一致，見圖3B。

4 ICA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的影響

如圖4 所示，在ISO 誘導(dǎo)作用下，H9c2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78 和GRP94 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從適應(yīng)生存到促進(jìn)凋亡轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵點(diǎn)，ISO 亦上調(diào)CHOP 的表達(dá)；而預(yù)給予ICA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA及β1受體拮抗劑Meto 后，GRP78 和GRP94 及CHOP 表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）。這一結(jié)果表明，ICA 抗ISO 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大損傷與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

討論

雖然已經(jīng)有研究證實(shí)淫羊藿的水提物可以改善ISO 誘導(dǎo)心力衰竭的心功能，但I(xiàn)CA 對(duì)ISO 誘導(dǎo)的心肌肥大的作用及其機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)還未知。本研究在離體心肌肥大模型上證實(shí)ICA 對(duì)心肌肥大有抑制作用，且抑制細(xì)胞凋亡，機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

心肌肥厚是在缺血、缺氧或壓力超負(fù)荷條件下的代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、凋亡細(xì)胞增多、心肌組織纖維化和膠原纖維在胞外沉積等。交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)激活是導(dǎo)致心肌肥厚的主要原因之一，而ISO 是非選擇性β 受體激動(dòng)劑，能通過刺激心臟β1受體，誘導(dǎo)心肌肥大，是公認(rèn)的建立心肌肥厚模型的主要試劑［11］。有研究表明，ISO增加細(xì)胞的能量代謝，增加氧自由基產(chǎn)生和Ca2+超載，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，采用ISO作用于H9c2細(xì)胞，處理48 h 之后，觀察到H9c2 細(xì)胞活力降低，細(xì)胞表面積增大，細(xì)胞凋亡率升高，證實(shí)ISO可以導(dǎo)致H9c2細(xì)胞肥大及肥大損傷［12-13］。

ICA是一種黃酮類化合物，對(duì)各種病理過程如中風(fēng)、缺血性再灌注等均發(fā)揮抗氧化、清除自由基的作用［14-15］。本研究也發(fā)現(xiàn)ICA 能抑制ISO 誘導(dǎo)的心肌肥大和細(xì)胞損傷，使LDH 釋放量減少，說(shuō)明ICA 對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。以往研究采用缺血再灌注大鼠模型發(fā)現(xiàn)ICA 有類似阻斷β1受體的作用，可以減慢心率［16］，所以本研究采用Meto作為陽(yáng)性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)ICA的作用與Meto有相似的作用。

Figure 3.The effect of icariin（ICA）on the apoptosis of H9c2 cells induced by 10 μmol/L isoproterenol（ISO）.A：Hoechst 33258 staining（×200）；B：DAPI（blue）and TUNEL staining（green）（×200）.4-PBA：4-phenylbutyric acid（5 mmol/L）；Meto：metoprolol（5 μmol/L）.Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ISO group.圖3 ICA對(duì)ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是亞細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，可清除損傷的細(xì)胞器和非折疊蛋白，減少蛋白的合成，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，應(yīng)激反應(yīng)可保護(hù)心肌組織；但長(zhǎng)時(shí)間過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，因此抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激成為預(yù)防與治療心血管疾病的靶點(diǎn)［2，17-19］。GRP78 與GRP94 是激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)特異性標(biāo)志分子，CHOP已被證明是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)通路的關(guān)鍵分子，上調(diào)CHOP 通路可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而抑制CHOP 對(duì)缺氧缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的藥物（如4-PBA、柚皮素等）對(duì)病理狀態(tài)下的心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用［20-22］。本研究也發(fā)現(xiàn)ISO 上調(diào)GRP78、GRP94 和CHOP 表達(dá)，說(shuō)明ISO 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞肥大損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

以往我們的研究發(fā)現(xiàn)ICA 在衣霉素誘導(dǎo)的心肌損傷中可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而降低細(xì)胞凋亡率，減輕心肌細(xì)胞損傷。為了進(jìn)一步證明ICA 對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌肥大損傷模型的作用機(jī)制，本研究采用4-PBA 作陽(yáng)性對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICA 可以下調(diào)GRP78、GRP94 和CHOP 表達(dá)，降低ISO 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明ICA 可減輕ISO 誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大損傷，且其機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)ICA 可以減輕ISO 誘導(dǎo)的心肌肥大，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞活力，其機(jī)制可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。

Figure 4.The effect of icariin（ICA）on the protein levels of endoplasmic reticulum stress-related molecules GRP78（A），GRP94（B）and CHOP（C）detected by Western blot.ISO：isoproterenol（10 μmol/L）；4-PBA：4-phenylbutyric acid（5 mmol/L）；Meto：metoprolol（5 μmol/L）.Mean±SEM. n=5.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ISO group.圖4 ICA對(duì)ISO誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)蛋白的影響