腸道ChREBP缺陷導(dǎo)致小鼠對果糖不耐受*

張 晶，陸俊宇，閆學德，蘇 凱，曹冬梅，章衛(wèi)平

（海軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室，上海 200433）

高果糖玉米糖漿由于成本低、甜度高等優(yōu)點，作為甜味劑被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。果糖雖與葡萄糖分子量完全相同，但二者在哺乳動物中的代謝路徑有顯著差異［1］。近年來，大量流行病學資料和實驗研究表明，果糖攝入過量可能是肥胖、高血脂、高血壓、胰島素抵抗和高尿酸血癥的危險因素［2］，且與糖尿病、脂肪肝和痛風等代謝性疾病的發(fā)病率升高密切相關(guān)，因此，有關(guān)果糖代謝及其調(diào)節(jié)機制的研究是代謝領(lǐng)域的前沿熱點。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白5（glucose transporter 5，GLUT5）是參與小腸吸收果糖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運子，主要分布于小腸上皮細胞的刷狀緣，其編碼基因為Slc2a5［3-4］；而GLUT2 負責將葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)運到血液循環(huán)，主要分布于基底膜外側(cè)，其編碼基因為Slc2a2［5］。與葡萄糖不同，腸道對于果糖的吸收能力很容易達到飽和，成年人每天吸收果糖的飽和劑量約為5～50 g。

碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbohydrate re?sponse element binding protein，ChREBP）是調(diào)控果糖代謝的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，通常以與Max 樣蛋白（Maxlike protein X，MLX）形成異源二聚體的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［6］，兩者都是螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-he?lix）轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)［7］。由于所用啟動子和第1 外顯子的差異，ChREBP 蛋白有α 和β 兩種不同的亞型［8］，正常細胞中存在的ChREBP 主要是α 亞型，但目前認為ChREBP 的主要活性形式是β 亞型，其主要分布于核內(nèi)，蛋白水平非常低，但體外的轉(zhuǎn)錄活性是α 亞型20倍。ChREBP全身敲除小鼠對果糖不耐受，在高果糖飲食后出現(xiàn)體溫降低，約半數(shù)小鼠在一周內(nèi)死亡，表明ChREBP 是維持機體果糖耐受所必需的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。ChREBP在肝臟組織、脂肪組織、小腸組織、肌肉組織、腎臟組織及胰島β 細胞中均存在高表達［9］，參與了糖酵解、脂質(zhì)合成、果糖分解和糖異生等代謝通路中眾多關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［10］。然而，在ChREBP維持機體果糖耐受過程中，發(fā)揮關(guān)鍵作用的代謝器官和代謝環(huán)節(jié)是什么？ChREBP 如何感應(yīng)果糖變化？其中涉及到哪些生化機制？這些科學問題亟待解決。以往認為，肝臟是哺乳動物果糖代謝的主要器官，新近研究發(fā)現(xiàn)攝入的低劑量果糖主要在小鼠小腸上皮細胞中轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟呛陀袡C酸等代謝產(chǎn)物，攝入的過量果糖經(jīng)門靜脈進入肝臟代謝，提示小腸在果糖代謝中發(fā)揮重要作用［11］。鑒于小腸在果糖代謝過程中的核心地位，本研究利用Cre/loxP 系統(tǒng)構(gòu)建了ChREBP的腸道特異性基因敲除小鼠模型，研究腸道ChREBP 是否在果糖反應(yīng)性激活小腸上皮細胞表達GLUT5和維持果糖耐受中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1 動物

ChREBPflox/+小鼠由本實驗室委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司構(gòu)建，為C57BL/6J 和129/Sv混合遺傳背景，在ChREBP基因8號外顯子兩端分別插入loxP 位點［12］；Villin-Cre 工具鼠［B6.Cg-Tg（Vil-Cre）977Gum/J］引自Jackson 實驗室，該工具鼠只在腸道上皮細胞中表達Cre 酶［13］。將ChREBPflox/+小鼠與Villin-Cre 工具鼠交配獲得ChREBPflox/floxVillin-Cre小鼠，即ChREBP的腸道特異性基因敲除（ChREBP?gut-specific knockout，ChGO）小鼠。小鼠按照SPF 級動物飼養(yǎng)標準在本實驗室飼養(yǎng)繁殖，環(huán)境溫度25℃，濕度40%～70%，小鼠飼料、墊料和飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，光照周期為12 h光照/12 h黑暗。

2 主要試劑

鼠尾基因組DNA 裂解液［0.2% SDS、0.2 mol/L NaCl、0.005 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和0.5 mol/L 蛋白酶K）；尿素裂解液［0.025 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1% SDS、8 mol/L 尿素、0.001 mol/L EDTA 和0.14 mol/L β-巰基乙醇］；Trizol 和DNA marker（TaKaRa）；瓊脂糖（BioFROX）；PCR Mix（上海旭飛生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工生物技術(shù)公司合成）；anti-ChREBP 抗體（SC-33764，Santa Cruz）；anti-β-Actin 抗體（66009-1，Protein?tech）；anti-GLUT5 抗體（SC-271055，Santa-Cruz）；65%高果糖飼料（D11707R，Research Diet）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）；SYBR Green Real-time PCR Mas?ter Mix（A25742，Thermo Fisher）；DMEM 培養(yǎng)基（HyClone）；Effectene 基因轉(zhuǎn)染試劑盒（QIAGEN）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 小鼠基因型的鑒定 取3 周齡小鼠尾巴，用蛋白酶K 消化法提取基因組DNA 進行PCR 鑒定。loxP的上、下游引物序列參照本實驗室文獻［12］，野生型的等位基因的擴增產(chǎn)物為593 bp，重組的等位基因的擴增產(chǎn)物為681 bp。PCR 反應(yīng)條件為95℃1 min；95℃15 s、54℃15 s、72℃30 s，共30 個循環(huán)；72℃5 min。Cre 的上游引物序列為 5'-CCGGGT?GGGCAGGGTAGAGG-3'，下游引物序列為5'-GCA?GATGGCGCGGCAACAC-3'，擴增產(chǎn)物為912 bp。

3.2ChREBP基因敲除效果的Western blot分析 取8周齡ChGO小鼠和對照（wild type，WT）小鼠的空腸和肝臟，用尿素裂解液提取總蛋白后超聲處理，加入相應(yīng)量的上樣緩沖液后，進行SDS-PAGE，而后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h。用抗ChREBP抗體或抗β-actin抗體孵育過夜（按照1∶1 000比例稀釋抗體），TBST緩沖液洗3遍，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠多聚抗體（按照1∶5 000比例稀釋抗體），室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗3遍，加入ECL 試劑，放入化學發(fā)光分析系統(tǒng)（Fujifilm）掃描分析。

3.3 組織免疫熒光染色 取8 周齡的ChGO 小鼠和對照小鼠的空腸和肝臟，經(jīng)4%的多聚甲醛固定過夜，PBS 洗15 min×3 次，在4℃的PBS 中浸泡過夜，然后依次在50%、65%、85%和95%的乙醇中浸泡1 h脫水處理后，在95%的乙醇中浸泡過夜，而后在無水乙醇中浸泡45 min×3次，常規(guī)石蠟包埋、切片。切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水后，進行抗原修復(fù)，然后用0.01 mol/L 的PBS 漂洗5 min×3 次，滴加10% BSA 在37℃濕盒內(nèi)封閉30 min，然后吸盡封閉液，加入Ⅰ抗（抗ChREBP抗體和抗GLUT5抗體，1∶2 000），將玻片置于濕盒中，于4℃冰箱中孵育過夜。PBS 漂洗5 min×3 次，避光加入Ⅱ抗，37℃溫箱中避光孵育90 min，PBS 漂洗2 次，避光滴加DAPI，室溫下孵育20 min，PBS漂洗2次，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，陰性對照用PBS 代替I 抗。胞核及胞漿中出現(xiàn)紅色或藍色熒光為陽性細胞，陰性對照細胞不出現(xiàn)熒光。

3.4 小鼠的果糖耐受性分析 取8 周齡ChGO 小鼠和對照小鼠，給予65%高果糖飼料飲食，每天監(jiān)測其體重和攝食量。分別于高果糖飲食17 h 和2 周后處死小鼠，剖腹觀察盲腸和結(jié)腸外觀，取空腸用于蛋白和mRNA 水平的檢測，另取空腸和肝臟進行免疫組化分析。

3.5 RT-qPCR 檢測ChREBP、Slc2a5和Slc2a2的表達 取實驗小鼠的空腸，用Trizol 抽提總RNA 后，進行DNA 酶處理和逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。ChREBP的上游引物序列為5'-CGACACTCACCCACCTCTTC-3'，下游引物序列為5'-TTGTTCAGCCGGATCTTGTC-3'，退火溫度為59℃；Slc2a5的上游引物序列為5'-GGAGCTGGCCCCGAAAAACCTACG-3'，下游引物序列為5'-CCGCCGCCTTCTCAGCCTCATC-3'，退火溫度為63℃；Slc2a2的上游引物序列為5'-TTCCTT?GGGCCTTACGTGTTCTTC-3'，下游引物序列為5'-CCTGGTCGGTTCCTCGGTTTTAG-3'，退火溫度為57℃。定量PCR 以36B4為內(nèi)參照，上游引物序列為5'-TGGTTGCTTTGGCGGGATTAGTCG-3'，下游引物序列為5'-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCTGTG-3'，采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達量。

3.6Slc2a5啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分析 在小鼠腸道中，Slc2a5基因的啟動子區(qū)包含了該基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1532/+1 個核苷酸區(qū)段，將這一段DNA 經(jīng)XhoI/HindⅢ酶切，克隆進pGL4.11-Basic 載體，得到的質(zhì)粒簡稱為Slc2a5-1.5Luc（本室質(zhì)粒庫編號#785）?；趐CMV-Tag 2B 載體構(gòu)建的小鼠ChREBPβ 表達質(zhì)粒（編號#486）和基于pCMV-Tag 2B 載體構(gòu)建的小鼠Mlx-β表達質(zhì)粒（編號#789）由本室構(gòu)建、保存。將HEK293-A 細胞接種于24 孔板，每孔8×104個細胞，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細胞密度達到40%～70%時，用脂質(zhì)體Effectene 進行基因轉(zhuǎn)染，以RL-SV40 質(zhì)粒為內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染24 h 后裂解細胞，用雙螢光素酶檢測試劑盒（Promega）、Glo?Max 化學發(fā)光檢測儀檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶活性，算出比值，用第1 組的平均值標化后計算出相對螢光素酶報告基因活性倍數(shù)。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 ChREBP基因腸道特異性敲除小鼠的構(gòu)建

將ChREBPflox/+小鼠與Villin-Cre 小鼠進行交配，最終獲得ChREBP基因腸道特異性敲除的ChGO 小鼠（圖1）。

Figure 1.Schematic demonstration for the generation of ChREBP gene gut-specific knockout mouse model.NLS：nuclear localization signal；Pro-rich：proline-rich domain；b-HLH：basic helix-loop-helix；ZIP：Zipper.圖1 ChREBP基因腸道特異性敲除小鼠模型的構(gòu)建流程

2 ChREBP基因敲除效率和組織特異性的分析

為了進行快速批量的基因型分析，本研究利用針對第8 外顯子下游的loxP 位點設(shè)計的基因型鑒定引物，結(jié)合Cre 的鑒定結(jié)果，可快速判斷小鼠的基因型，基因型為flox/flox/Cre 的小鼠即為ChREBP基因成功敲除（圖2A）。取ChGO 小鼠和對照小鼠的空腸和肝臟組織，分別提取蛋白和mRNA 進行Western blot 檢測和RT-qPCR 檢測，結(jié)果都表明ChGO 小鼠的空腸組織中沒有檢測到ChREBP 表達，而對照小鼠的空腸組織中檢測到ChREBP 表達，說明在ChGO 小鼠空腸組織中已經(jīng)成功敲除了ChREBP基因；在對照基因和ChGO 小鼠肝臟組織內(nèi)ChREBP 的表達水平?jīng)]有明顯差別，說明肝臟中的ChREBP 水平不受影響（圖2B、C）。免疫熒光染色分析顯示，未饑餓狀態(tài)下的對照小鼠空腸上皮細胞中ChREBP 表達豐富，主要位于胞核，而在ChGO 小鼠空腸上皮細胞中未檢測到ChREBP 表達（圖2D）；而ChREBP 在對照小鼠和ChGO小鼠肝細胞中的表達并沒有明顯差別，且主要位于細胞核，表明ChREBP 蛋白在ChGO 小鼠空腸上皮細胞中被特異性敲除，同時肝臟組織中ChREBP的表達及其核定位不受影響。

Figure 2.Analysis of ChREBP deletion efficiency and tissue specificity.A：representative demonstration for PCR-based genotyping with tail genomic DNA；B：Western blot analysis for ChREBP protein expression in the jejunum and liver；C：relative mRNA expression levels of ChREBP in the jejunum and liver；D：immunofluorescence staining for ChREBP（red）in the je?junum and liver of ChGO and WT mice（×10）.Mean±SD. n=18.ND：not detectable.圖2 ChREBP基因敲除效率和組織特異性的分析

3 ChREBP基因腸道特異性敲除小鼠的表型分析

普食條件下，成年ChGO 小鼠與WT 小鼠的體重沒有明顯差異，但在65%高果糖飲食2 周后，ChGO小鼠相較于WT 小鼠，體重明顯減輕（P＜0.01，圖3A）。在65%高果糖飲食36 h 后，相較于WT 小鼠，ChGO 小鼠出現(xiàn)攝食量明顯減少（P＜0.01，圖3B）和體重明顯減輕（P＜0.01，圖3C）。普食條件下，ChGO和WT 小鼠大小腸外觀均正常，但在高果糖飲食2 周后，ChGO 小鼠出現(xiàn)盲腸明顯脹氣膨大，而WT 小鼠大小腸外觀正常（圖3D）。研究期間對于ChGO 小鼠和WT 小鼠，取材達50 對，高果糖飲食后的每只ChGO 小鼠均會出現(xiàn)盲腸脹氣的表現(xiàn)。這些都表明，腸道ChREBP被敲除后，機體對果糖嚴重不耐受。從小鼠空腸HE組織切片染色可以看出，無論是在普食狀態(tài)還是高果糖飲食后，ChGO 小鼠與WT 小鼠的腸道內(nèi)部形態(tài)沒有明顯差異（圖3E）。

4 腸道ChREBP 基因敲除對果糖轉(zhuǎn)運子基因表達的影響

Figure 3.Deletion of ChREBP gene in the gut results in fructose intolerance.A：body weight of female ChGO and WT mice fed with 65% high-fructose diet（HFR）for 2 weeks；B and C：food intake（B）and body weight gain（C）of female ChGO and WT mice fed with 65% high-fructose diet（HFR）for 36 h；D and E：representative images of small intestine，cecum and colon in situ（D）and HE-stained jejunal sections（E）of 50 pairs of ChGO and WT mice after 2 weeks of normal chow or HFR taken（×10）.The blue arrows point to the stomach，and the red arrows point to the cecum.Mean±SD. n=18.**P＜0.01 vs WT group.圖3 ChREBP基因腸道特異性敲除導(dǎo)致果糖不耐受

普食條件下，ChGO 小鼠與對照小鼠腸道Slc2a5水平?jīng)]有明顯差別；但是在65%高果糖飲食17 h后，對照小鼠腸道Slc2a5水平相較普食時大幅上升，而ChGO 小鼠的腸道Slc2a5水平與普食時相比沒有明顯變化（圖4A）。免疫熒光染色分析顯示，普食條件下ChGO 小鼠與對照小鼠腸道GLUT5 蛋白水平都非常低，且沒有明顯差別；但是在高果糖飲食2 周后，對照小鼠腸道GLUT5 水平相較普食時顯著上調(diào)，且主要分布于空腸上皮細胞刷狀緣，而ChGO小鼠空腸GLUT5 水平與普食時相比沒有明顯變化（圖4B），這說明高果糖飲食上調(diào)了對照小鼠腸道Slc2a5水平，提示其腸道對于果糖的吸收能力增強；但在ChGO小鼠體內(nèi)，高果糖刺激幾乎喪失對腸道Slc2a5的激活作用，提示腸道ChREBP 的表達在高果糖飲食對于腸道Slc2a5的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)中有決定性作用。無論是普食條件下還是高果糖飲食后，腸道ChREBP的敲除都會引起腸道表達Slc2a2下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖4A）。另外，對照小鼠在高果糖飲食后腸道Slc2a2相較于普食時沒有明顯變化，但是Slc2a5卻明顯上調(diào)，說明小腸上皮細胞Slc2a5是受到果糖激活的主要轉(zhuǎn)運子。

5 ChREBP調(diào)控Slc2a5基因轉(zhuǎn)錄活性

為了體外分析ChREBP 對Slc2a5基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用，我們克隆了小鼠Slc2a5基因啟動子，發(fā)現(xiàn)其在HEK293A 細胞中有較強的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性；ChREBP-β和Mlx-β共轉(zhuǎn)染能有效激活Slc2a5基因啟動子，提示ChREBP 可直接激活Slc2a5基因的轉(zhuǎn)錄，見圖5。

討論

果糖攝入過量是代謝綜合征的重要危險因素［14-15］。ChREBP 被認為是調(diào)控果糖代謝的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，是維持機體果糖耐受所必需的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但其發(fā)揮這一作用的確切機制及組織定位尚不清楚。本實驗室為了更好地研究ChREBP 在果糖代謝中的生物學功能，利用Cre/loxP 系統(tǒng)建立了ChREBP肝臟敲除小鼠模型。肝臟ChREBP敲除的小鼠出現(xiàn)肝臟糖原蓄積和ATP 穩(wěn)態(tài)紊亂，可能是其肝臟毒性的重要原因［12］。但是單純的肝臟毒性尚不足以解釋ChREBP全身敲除導(dǎo)致的果糖不耐受，ChREBP 在肝臟、腸道、骨骼肌和脂肪組織中都有豐富表達，其維持機體果糖耐受這一作用的關(guān)鍵組織定位仍待進一步探究。

Figure 4. ChREBP deletion resulted in loss of transcriptional activation of Slc2a5 by fructose in intestinal.A：relative mRNA levels of fructose transporters in the intestine of ChGO and WT mice after 17 h of HFR or normal chow；B：immunofluorescence staining for GLUT5（red）in the jejunum of ChGO and WT mice after 2 weeks of HFR or normal chow（×20）.Mea±SD. n=18.**P＜0.01 vs WT chow group；#P＜0.05 vs WT fructose group.圖4 ChREBP基因缺陷導(dǎo)致果糖喪失對腸道Slc2a5基因的轉(zhuǎn)錄激活作用

最新的13C 示蹤實驗發(fā)現(xiàn)，攝入的低劑量果糖主要在小鼠的小腸上皮細胞中轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟呛陀袡C酸等代謝產(chǎn)物，過多攝入的果糖經(jīng)門靜脈至肝臟代謝，提示小腸在果糖代謝中發(fā)揮重要作用［11］。因此本研究基于實驗室前期構(gòu)建的ChREBP的條件敲除小鼠模型，利用Cre/loxP 系統(tǒng)［16］構(gòu)建了ChREBP的腸道敲除小鼠模型，并在基因組、mRNA 和蛋白水平驗證了該模型的基因敲除效率和組織特異性。ChGO 小鼠在高果糖飲食后出現(xiàn)明顯腸脹氣、攝食量減少和體重明顯減輕等果糖嚴重不耐受表現(xiàn)，推測是由于腸脹氣嚴重，ChGO 小鼠攝食量下降，繼而體重減輕。進一步分析腸道果糖轉(zhuǎn)運子的表達，腸道ChREBP敲除后高果糖飲食喪失對于腸上皮Slc2a5的轉(zhuǎn)錄激活作用。這些結(jié)果都說明腸道ChREBP 對于機體維持果糖耐受有至關(guān)重要的作用。最近的研究報道也顯示，機體果糖耐受所必須的是腸道ChREBP，而非肝臟ChREBP［17］。我們通過報告基因檢測，發(fā)現(xiàn)ChREBP-β/Mlx-β 能顯著促進Slc2a5基因的轉(zhuǎn)錄，這一結(jié)果提示Slc2a5可能是受ChREBP 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因，而ChREBP調(diào)控Slc2a5可能是機體維持果糖耐受中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另外，早期研究表明GLUT5全身敲除小鼠在高果糖飲食后，會有嚴重腸脹氣，體重明顯減輕［3］，其與ChGO 小鼠表型的相似性也提示Slc2a5是ChREBP 的靶基因。后續(xù)還需繼續(xù)檢測果糖代謝通路上的其他關(guān)鍵分子的表達，分析果糖代謝各環(huán)節(jié)的變化，并通過分子生物學和細胞學實驗證實ChREBP 對于Slc2a5的激活作用。果糖在人體中的能量代謝機理和病理作用正受到廣泛關(guān)注，研究ChREBP 維持果糖耐受的確切機制對于緩解果糖過度攝入造成的代謝綜合征有重要價值。本研究構(gòu)建的ChREBP腸道特異性敲除小鼠模型為探索腸道ChREBP 在果糖代謝中的具體作用機制提供了新思路和可靠基礎(chǔ)。

Figure 5.ChREBP-β promoted the Slc2a5 gene transcription significantly.Relative luciferase activity of HEK293-A cells after 24 h of transfection of different plasmid was showed.Mea±SD. n=18.**P＜0.01 vs control group.圖5 ChREBP-β/Mlx-β顯著促進Slc2a5基因的轉(zhuǎn)錄