機(jī)械敏感性離子通道Piezo1參與慢性避水應(yīng)激腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟高敏感性和5-羥色胺代謝異常*

何蘇月，馬卓琳，范昕然，龐瑞萍

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，中山大學(xué)疼痛研究中心，廣東廣州 510080）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種普遍的胃腸道功能性疾病，主要表現(xiàn)為腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和（或）大便性狀的改變，但無(wú)明顯的器質(zhì)性變化。不少患者還有抑郁、焦慮、睡眠障礙等胃腸道外癥狀［1-3］。長(zhǎng)期的慢性疾病對(duì)人們的日常生活和工作活動(dòng)都帶來(lái)了嚴(yán)重的影響，也加重了醫(yī)療負(fù)擔(dān)。IBS的病因及發(fā)病機(jī)制尚無(wú)明確定論，目前的研究表明，精神因素、遺傳因素、感染及內(nèi)分泌因素導(dǎo)致IBS 的發(fā)生。對(duì)于發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)有的理論研究、臨床觀察等證實(shí)了內(nèi)臟感覺(jué)過(guò)敏、胃腸動(dòng)力異常及腦-腸軸的改變與IBS的發(fā)生有著密切的關(guān)系［4-7］。

感受機(jī)械力對(duì)于維持正常的胃腸道功能非常重要，機(jī)械感受的功能障礙常常導(dǎo)致胃腸道功能紊亂及病變。機(jī)械敏感性離子通道（mechanosensitive ion channels，MSC）是一類(lèi)能將機(jī)械力信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娀瘜W(xué)信號(hào)的離子通道，廣泛分布于各組織器官中，在多種力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中都具有重要的生理作用，參與生物體內(nèi)的多種生理過(guò)程，包括觸覺(jué)、痛覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、剪應(yīng)力等［8-9］，但其分子特性尚未被充分認(rèn)識(shí)。2010 年Coste 等［10］發(fā)現(xiàn)Piezo基因家族，包括Piezo1 和Piezo2，編碼哺乳動(dòng)物機(jī)械敏感性陽(yáng)離子通道。目前研究顯示，Piezo1在肺、心臟、血管、十二指腸、結(jié)腸等部位都有所表達(dá)，并且在多種力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中都具有重要的生理作用，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的機(jī)械敏感性陽(yáng)離子通道，可將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)［11-12］。但是Piezo1在IBS中的作用尚不清楚。

在IBS的發(fā)病機(jī)制中，胃腸道分泌和動(dòng)力異常具有重要的作用，而5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是腸道動(dòng)力和感受的關(guān)鍵信號(hào)分子，在調(diào)控胃腸運(yùn)動(dòng)及感知功能中發(fā)揮重要作用［13-15］。5-HT 主要來(lái)源于腸嗜鉻（enterochromaffin，EC）細(xì)胞和腦干神經(jīng)元，因?yàn)椴荒芡高^(guò)血腦屏障，所以體內(nèi)95%的5-HT由EC細(xì)胞分泌的。腸道來(lái)源的5-HT大多數(shù)被血小板吸收，在特定的刺激作用下釋放并參與多種生理活動(dòng)如血小板聚集、腸道蠕動(dòng)、腸道炎癥等［16］。最近，Sugisawa 等［17］的研究結(jié)果顯示，糞便中的單鏈RNA（signle-strand RNA，ssRNA）是Piezo1 的天然配體，腸道上皮組織特異性Piezo1敲除的小鼠腸蠕動(dòng)減緩，血清中5-HT水平也相應(yīng)降低，ssRNA-Piezo1軸介導(dǎo)了腸蠕動(dòng)和腸道5-HT的分泌和合成。

本研究觀察了機(jī)械敏感性Piezo1 離子通道在慢性避水應(yīng)激（water avoidance stress，WAS）大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)的情況，并探討其與大鼠內(nèi)臟敏感性和結(jié)腸組織5-HT 的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究機(jī)械感受在IBS發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［18］。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2016-0029。

2 主要試劑

兔抗大鼠Piezo1（15939-1-AP）購(gòu)于Proteintech；驢抗小鼠IgG 和驢抗兔IgG 購(gòu)于Jackson Immuno Re?search；DAPI購(gòu)于Beyotime；大鼠5-HT ELISA試劑盒（CSB-E08364r）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；RT-qPCR 試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；Western blot Ⅰ抗稀釋液，以及免疫熒光封閉液、Ⅰ抗稀釋液和Ⅱ抗稀釋液購(gòu)自碧云天；伊文斯藍(lán)和甲基纖維素購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；由捷瑞公司設(shè)計(jì)并合成引物；其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)。

3 主要方法

3.1 IBS 的大鼠模型制備和實(shí)驗(yàn)分組 WAS 裝置由一個(gè)有機(jī)玻璃水箱（45 cm×25 cm×25 cm）和一個(gè)固定在中央的有機(jī)玻璃臺(tái)子（10 cm×8 cm×8 cm）組成。水箱里裝滿(mǎn)了干凈水（25℃），距離有機(jī)玻璃臺(tái)子頂部不到1 cm。根據(jù)WAS 方案，將動(dòng)物放置在中間的有機(jī)玻璃臺(tái)子上，每天1 h，連續(xù)10 d，具體實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1A，實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1B。對(duì)照（control，CON）組大鼠每天放在同樣的裝置（但無(wú)水）中1 h，連續(xù)10 d［18］。

3.2 胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的檢測(cè) 先將大鼠禁食不禁水過(guò)夜，然后用含有5%伊文思藍(lán)和1.5%甲基纖維素的溶液灌胃，每只1 mL，然后將大鼠放進(jìn)代謝籠內(nèi)，給予正常的飼料和水，觀察記錄第一個(gè)藍(lán)色糞便排出的時(shí)間［18-19］。

3.3 糞便含水量和糞便顆粒數(shù)的檢測(cè) 將大鼠放在代謝籠里24 h，給予足夠的食物和水。收集糞便，記錄糞便顆粒數(shù)并稱(chēng)重記為濕重（M0），烘干后再稱(chēng)重記為干重（M1），則糞便含水量（fecal water content）為（M0-M1）/M0［20-21］。

3.4 內(nèi)臟敏感性的測(cè)定和評(píng)分 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將大鼠禁食不禁水過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)先用少量異氟烷麻醉大鼠，把固定在導(dǎo)管一端的氣囊經(jīng)石蠟油潤(rùn)滑后，經(jīng)大鼠肛門(mén)插入一定深度，用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾巴根部纏在一起，以固定氣囊。將大鼠放在不能轉(zhuǎn)身的透明塑料籠內(nèi)，待其適應(yīng)至完全平靜后，用血壓計(jì)法緩慢向氣囊內(nèi)注氣以擴(kuò)張腸道（colorectal dis?tention，CRD），血壓計(jì)注氣的方式是按血壓計(jì)每10 mmHg 上升的速度注入空氣，分別觀察在20、40、60和80 mmHg 不同壓力值下腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR），每次擴(kuò)張持續(xù)20 s，每測(cè)量一次中間休息3 min，同時(shí)給予評(píng)分，以得分高低判斷內(nèi)臟敏感性程度。為了獲得更準(zhǔn)確的評(píng)分，每個(gè)分級(jí)的結(jié)直腸擴(kuò)張重復(fù)3 次，并使用AWR 的平均評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［22-23］。

3.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open-field test）將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。觀察一定時(shí)間后停止攝像，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清洗方箱內(nèi)壁及底面，以免上次動(dòng)物余留的信息（如動(dòng)物的大便、小便、氣味等）影響下次測(cè)試結(jié)果。更換動(dòng)物，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。每只動(dòng)物進(jìn)行1 次，持續(xù)10 min，最后根據(jù)曠場(chǎng)自帶的軟件（Topscan）進(jìn)行分析［24］。

3.6 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test）將直徑20 cm、高45 cm 的透明游泳桶中注入新鮮水［水溫（24±1）℃］，水位高度為30 cm，確保大鼠的鼠尾不會(huì)接觸桶底。依次將每只大鼠置于游泳桶中，每只大鼠測(cè)試1 次，觀察大鼠6 min 內(nèi)后4 min 的不動(dòng)時(shí)間，并記錄時(shí)長(zhǎng)，一般來(lái)說(shuō)漂浮不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)絕望指數(shù)越高［25］。

3.7 Western blot 實(shí)驗(yàn) 各組動(dòng)物腹腔注射20%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉后，于冰上取結(jié)腸組織（直腸上1 cm）放入液氮中冷凍，加入SDS 裂解液（10 mL/g）和蛋白酶抑制劑勻漿并超聲破碎，再低溫離心后取上清液，-80℃保存待用；上清液經(jīng)SDS-PAGE 分離，再濕轉(zhuǎn)于PVDF 膜上；經(jīng)5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，再于4℃與Ⅰ抗（1∶1 000；Proteintech）輕搖孵育過(guò)夜；第2 天取出，室溫復(fù)溫1 h，TBST 洗3 遍，每遍5 min；與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶2 000；Pro?teintech）孵育1 h 后，TBST 洗3 遍，ECL 顯色曝光；使用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

3.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉，取結(jié)腸（直腸上1 cm）置于無(wú)酶EP管中，每管內(nèi)加入500 μL Trizol，用事先DEPC處理且高壓滅菌過(guò)的研磨棒將組織研磨碎；加入100 μL氯仿吹打混勻，靜置3 min后于4℃、12 000×g離心15 min；吸出200 μL 上清液轉(zhuǎn)移到新的無(wú)酶EP 管中，加入200 μL異丙醇，上下輕搖30次左右，靜置10 min后于4℃、12 000×g離心10 min，棄上清；加入1 mL DEPC 水配制的75%乙醇溶液，4℃、7 500×g離心5 min，離心后將液體吸干，倒扣在濾紙上；待殘余液體揮發(fā)后，加入適量DEPC 水溶解RNA 沉淀，使用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）測(cè)定RNA 濃度和質(zhì)量，A260/A280在1.8～2.0 之間的樣品方可進(jìn)行后續(xù)步驟。使用Evo M-MLV RT Premix（AG11706）試劑盒和S1000?PCR 儀（Bio-Rad）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS（AG11701）試劑盒和CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（Bio-Rad）測(cè)定Piezo1 的mRNA 表達(dá)。Piezo1 和內(nèi)參照β-actin 的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Piezo1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.9 免疫組化實(shí)驗(yàn) 大鼠麻醉后，心臟抽血將血抽干凈后，取結(jié)腸組織1 cm，剪開(kāi)腸壁組織并平鋪于光滑的平面上，滴入4%的甲醛固定30 min，再裝入事先準(zhǔn)備好的加了1 mL 甲醛的EP 管中，后固定12 h后，石蠟包埋，縱切成5 μm 厚的切片。然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先烤片30 min，二甲苯脫蠟15 min×2，100%乙醇（I）15 min，100%乙醇（II）5 min，95%乙醇3 min×2，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，蒸餾水3 min，PBS 洗3 min×3；用EDTA（pH 9）進(jìn)行抗原修復(fù)，微波爐高火15 min，中火15 min，冷卻至室溫30 min，PBS洗3 min×3；用3.0% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，然后3%～5%牛血清白蛋白室溫封閉60 min；按照試劑盒說(shuō)明加Ⅰ抗，再次PBS 洗10 min×3，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的通用型Ⅱ抗室溫孵育60 min，PBS 洗5 min×3；使用Bx51 顯微鏡（Olympus）觀察并拍照，用ImageJ對(duì)圖片中的A值進(jìn)行半定量分析［26］。

3.10 ELISA實(shí)驗(yàn) 將各種試劑移至室溫（18～25℃）平衡至少30 min，在此期間配制好洗滌工作液，將酶標(biāo)板取出，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔（不加任何液體），每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)兩孔，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，其余每孔直接加待測(cè)樣品50 μL。然后每孔加入同樣體積的酶結(jié)合物（空白對(duì)照孔除外），再按同樣的順序加入同體積的抗體，混勻，貼上不干膠封片，置于37℃溫育1 h。手工洗版，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌緩沖液200 μL，靜置10 s 甩干，重復(fù)3 次。每孔加入顯色劑A 液50 μL，顯色劑B 液50 μL，振蕩混勻后，37℃避光顯色15 min，每孔加入同體積的終止液。最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（A）。在反應(yīng)終止10 min內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

3.11 HE 染色 先將組織放入烘箱30 min，然后放入二甲苯（I）中15 min，放入二甲苯（II）中15 min，100%乙醇（I）中15 min，100%乙醇（II）中5 min，95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min，蒸餾水3 min，蘇木素染色5～15 min，流水沖洗2 min，鹽酸酒精分化10 s，放入流水中50 min，放入蒸餾水3 min，伊紅溶液染10 s，90%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇（I）中3 min，100%乙醇（II）中3 min，二甲苯（I）中5 min，二甲苯（II）中5 min，中性樹(shù)脂封片，放入烘箱60 min后鏡下觀察。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。AWR 數(shù)據(jù)組間比較用兩因素方差分析（two-way ANOVA）；Piezo1 表達(dá)水平與內(nèi)臟敏感閾值和AWR 評(píng)分的關(guān)系采用采用兩連續(xù)型隨機(jī)變量間的Spearman 秩相關(guān)；Piezo1表達(dá)水平與5-HT 水平的關(guān)系采用兩連續(xù)型隨機(jī)變量間的Pearson 相關(guān)；其它數(shù)據(jù)組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合方差齊性，則采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 慢性WAS 大鼠出現(xiàn)IBS 樣腸道癥狀及內(nèi)臟高敏感性

如圖1A、B 所示，將大鼠每天1 h、連續(xù)10 d 進(jìn)行WAS，至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重，于造模完成后第1 天檢測(cè)24 h 糞便顆粒數(shù)及含水量。結(jié)果顯示，兩組大鼠體重變化無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1C；與對(duì)照組相比，WAS 組大鼠24 h 糞便顆粒數(shù)及糞便含水量均顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1D、E。

為了檢測(cè)大鼠內(nèi)臟敏感性的變化，我們進(jìn)行了AWR 實(shí)驗(yàn)。如圖2A 所示，隨著結(jié)直腸擴(kuò)張壓力的逐漸增加（20、40、60和80 mmHg），對(duì)照組AWR 評(píng)分分別為0.75±0.25、2.00±0.67、3.25±0.92 分和4.00±0（n=6），而WAS 組分別為1.14±0.48、3.29±0.24、4.00±0和4.00±0（n=6），表明WAS組大鼠內(nèi)臟敏感性顯著增加（P＜0.05）。以AWR 評(píng)分3 為疼痛閾值，顯示對(duì)照組引起疼痛的壓力閾值為（60.0±14.1）mmHg，而WAS 組為（43.3±7.5）mmHg，表明WAS 組大鼠出現(xiàn)顯著的內(nèi)臟高敏狀態(tài)（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。另外，腸道動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間為（258.7±41.6）min，而WAS 組大鼠為（207.2±67.3）min，較對(duì)照組顯著縮短（P＜0.05），見(jiàn)圖2C。

2 慢性WAS大鼠出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的變化

為了檢測(cè)WAS 后動(dòng)物是否出現(xiàn)神經(jīng)精神相關(guān)癥狀，我們將兩組大鼠分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組和WAS 組大鼠進(jìn)入中心位置的次數(shù)分別為29.0±15.0 和9.0±6.9，總的活動(dòng)路程分別為（9.7±4.0）m 和（6.6±1.8）m，與對(duì)照組相比，WAS 組大鼠進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)及總的活動(dòng)路程均顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖3A、B。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組和WAS 組大鼠漂浮時(shí)間分別為（135.0±52.1）s 和（210.4±32.9）s，與對(duì)照組相比，WAS 組大鼠漂浮不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），見(jiàn)圖3C。這些行為學(xué)數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，WAS 組大鼠出現(xiàn)了焦慮抑郁樣癥狀。進(jìn)一步的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組和WAS 組大鼠結(jié)腸組織黏膜結(jié)構(gòu)完整，固有層內(nèi)有稠密的大腸腺，細(xì)胞形態(tài)正常，黏膜下可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，肌層完整，與對(duì)照組相比，WAS 組沒(méi)有出現(xiàn)明顯的結(jié)腸病理學(xué)改變，見(jiàn)圖3D。

3 WAS對(duì)結(jié)腸黏膜和血清5-HT含量的影響

Figure 1.Foundation and intestinal symptoms of irritable bowel syndrome rat model induced by water avoidance stress（WAS）.A：experiment design was shown；B：device of WAS；C：the change of weight；D and E：the fecal water content and the num?ber of fecal particles in control（CON）and WAS rats.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖1 避水應(yīng)激腸易激大鼠模型的建立及腸道癥狀

Figure 2.Visceral hypersensitivity and whole gut transit time in water avoidance stress（WAS）-induced irritable bowel syndrome rat model.A：abdominal withdrawal reflex（AWR）scores measured in response to graded colorectal distension were signifi?cantly enhanced in WAS group compared with control（CON）group；B：the threshold of colorectal distention was obviously decreased in WAS group；C：the whole gut transit time was decreased in WAS rats.Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖2 避水應(yīng)激腸易激大鼠模型的內(nèi)臟高敏感性及胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間

為了檢測(cè)WAS是否影響大鼠5-HT的水平，我們檢測(cè)了兩組大鼠血清和結(jié)腸組織5-HT 含量。如圖4所示，ELISA 結(jié)果顯示，對(duì)照組和WAS 組血清中5-HT 含量分別為（8.00±2.1）μg/L 和（5.8±1.7）μg/L，結(jié)腸組織中5-HT 的含量分別為（3.1±0.5）μg/L 和（4.1±1.5）μg/L，與對(duì)照組相比，WAS 組大鼠結(jié)腸組織中5-HT 含量顯著增加（P＜0.05），而血清中5-HT含量呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4 WAS大鼠結(jié)腸黏膜Piezo1的表達(dá)情況

為了檢測(cè)WAS 對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜5-HT 含量的影響是否與Piezo1 表達(dá)有關(guān)，我們?nèi)?duì)照組和WAS 大鼠結(jié)腸組織，分別進(jìn)行RT-qPCR、Western blot及免疫組化實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)結(jié)腸組織Piezo1 表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，WAS 組大鼠結(jié)腸組織Piezo1 的mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），蛋白表達(dá)水平也顯著增加（P＜0.01）；免疫組化結(jié)果顯示，Piezo1 主要分布在腸上皮中，與對(duì)照組相比，WAS組免疫活性顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

5 結(jié)腸組織Piezo1 的表達(dá)水平與內(nèi)臟高敏感性及5-HT含量的相關(guān)性

Figure 3.Nervous system symptoms and colon histological changes of irritable bowel syndrome rat model induced by water avoidance stress（WAS）.A and B：the number of entering the center and the total distance in open-field test were significantly de?creased in WAS group compared with control（CON）group；C：the immobile duration in forced swimming test was pro?longed obviously in WAS group；D：representative images of the colon in CON and WAS rats with HE staining（scale bar=100 μm）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖3 避水應(yīng)激腸易激大鼠模型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及組織學(xué)變化

Figure 4.The content of 5-HT in colon tissue（A）and serum（B）of irritable bowel syndrome rat model induced by water avoidance stress（WAS）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（CON）group.圖4 避水應(yīng)激腸易激大鼠模型結(jié)腸組織及血清中5-HT 含量的變化

為了檢測(cè)慢性WAS 大鼠的內(nèi)臟敏感性是否可以由結(jié)腸Piezo1 表達(dá)水平來(lái)衡量，我們分析了Piezo1 mRNA表達(dá)水平與內(nèi)臟敏感閾值和AWR評(píng)分的相關(guān)性。如圖6A、B 所示，Piezo1 mRNA 表達(dá)水平與結(jié)直腸擴(kuò)張敏感閾值無(wú)顯著相關(guān)性（R2=0.231 7，P=0.310 6），而與AWR 評(píng)分呈顯著正相關(guān)（R2=0.542 0，P=0.037 3）。我們還檢測(cè)了結(jié)腸Piezo1 表達(dá)水平與5-HT 含量的相關(guān)性，結(jié)果顯示結(jié)腸Piezo1 mRNA 表達(dá)水平與5-HT 含量也呈顯著正相關(guān)（R2=0.835 1，P=0.010 8），見(jiàn)圖6C。

討論

IBS 的發(fā)病機(jī)制中胃腸道功能紊亂和心理因素起主導(dǎo)作用［27］。EC 細(xì)胞作為機(jī)械敏感性細(xì)胞可以感受胃腸蠕動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械力，并將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)從而引起5-HT 和ATP 釋放，因此在胃腸動(dòng)力、分泌及內(nèi)臟感受方面具有重要的生理功能。但EC 細(xì)胞作為機(jī)械感受器的分子機(jī)制尚未明了。我們的結(jié)果揭示在慢性WAS 誘導(dǎo)的IBS模型大鼠，結(jié)腸組織5-HT 含量增高的同時(shí)，機(jī)械敏感性離子通道Piezo1 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平升高，并且與內(nèi)臟敏感性顯著正相關(guān)。這些結(jié)果提示在慢性WAS 誘導(dǎo)的IBS 大鼠結(jié)腸組織中機(jī)械敏感性離子通道Piezo1 被激活，引起結(jié)腸組織5-HT 分泌和釋放增加，導(dǎo)致腸道功能紊亂和內(nèi)臟敏感性增高，以及神經(jīng)精神癥狀的出現(xiàn)。

Figure 5.Expression of Piezo1 in irritable bowel syndrome rat model induced by water avoidance stress（WAS）.A and B：the mRNA and protein expression levels of Piezo1 in the colon tissues were determined by RT-qPCR and Western blot；C：representa?tive immunohistochemistry images（scale bar=100 μm）and integrated absorbance of Piezo1 in the colon tissues of control（CON）and WAS rats.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖5 避水應(yīng)激腸易激大鼠模型結(jié)腸組織中Piezo1的表達(dá)情況

Figure 6.Correlations between Piezo1 mRNA expression and visceral hypersensitivity or 5-HT content in the colon.A：there was no obvious correlation between the mRNA expression of Piezo1 and the threshold of colorectal distension；B：correlation be?tween the AWR scores and the mRNA expression of Piezo1 in the colon；C：correlation between the 5-HT content and the mRNA expression of Piezo1 in the colon.圖6 結(jié)腸組織Piezo1的mRNA表達(dá)水平與內(nèi)臟高敏感性及5-HT含量的相關(guān)性

Piezo 家族離子通道是機(jī)械敏感性離子通道，在整個(gè)胃腸道都有表達(dá)，并具有特定的生物學(xué)特性，如非選擇性陽(yáng)離子通透性，快速激活但慢速至中等速度失活（Piezo1），快速激活快速失活（Piezo2），可以被機(jī)械敏感性離子通道阻斷劑釓離子（Gd3+）、釕紅（ru?thenium red）及GsMTx-4特異性阻斷［28］。胃腸道上皮細(xì)胞作為與外環(huán)境相互作用的第一道屏障，都是機(jī)械敏感性的，既可以感受靜水壓也可以感受急性力。感受靜水壓對(duì)于維持細(xì)胞密度的穩(wěn)態(tài)非常重要。有研究表明Piezo1 在上皮腫瘤抑制機(jī)制中具有重要作用［29］。感受急性力在消化和動(dòng)力過(guò)程中必不可少。在胃腸道上皮中，急性力是EC細(xì)胞所感受的［30］。EC細(xì)胞在機(jī)械和化學(xué)刺激作用下合成、貯存及釋放大量的5-HT；5-HT 反過(guò)來(lái)對(duì)于正常胃腸道分泌、動(dòng)力和感受非常重要［30］。Alcaino 等［31-32］的研究表明，機(jī)械敏感性EC 細(xì)胞需要Piezo2 來(lái)將機(jī)械力轉(zhuǎn)變?yōu)?-HT 的釋放。Bai 等［33］的研究表明，旋毛蟲(chóng)（Trichinel?la spiralis）感染后誘導(dǎo)的IBS 中，小鼠結(jié)腸Piezo2 表達(dá)水平與內(nèi)臟敏感性相關(guān)。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，機(jī)械刺激激活EC 細(xì)胞的機(jī)械感受器，誘導(dǎo)ATP 或UTP釋放，通過(guò)自分泌或旁分泌方式來(lái)調(diào)節(jié)5-HT 釋放［34］。但有很多問(wèn)題尚未明了，如Piezo2 具有快速激活快速失活的特性，在機(jī)械刺激時(shí)，Piezo2 在大約10 ms內(nèi)開(kāi)放和失活，這個(gè)時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于其后的5-HT釋放［35］。這提示在機(jī)械感受過(guò)程中存在信號(hào)的放大作用，和（或）需要多個(gè)機(jī)械感受器共同參與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。而除了Piezo2 外，機(jī)械敏感性離子通道Piezo1 也被證明對(duì)于胃腸道上皮感受靜水壓非常重要［36］。在軟骨細(xì)胞，Piezo1與Piezo2共同參與機(jī)械感受性反應(yīng)［37］。雖然我們尚不明確Piezo1 是否表達(dá)在EC 細(xì)胞，但Sugisawa 等［17］的研究表明腸道上皮細(xì)胞特異性敲除Piezo1會(huì)導(dǎo)致腸道和血清5-HT 含量減少，這表明Piezo1參與5-HT的合成和釋放過(guò)程。

5-HT 具有多種重要的生理功能，包括激活腸神經(jīng)分泌和運(yùn)動(dòng)反射、傳遞飽腹及疼痛信號(hào)、誘導(dǎo)嘔吐等，并且在炎癥的過(guò)程中也具有重要作用。在抑郁癥等情感障礙病人的血清及腦脊液中均有不同程度的5-HT 代謝紊亂。5-HT 無(wú)論在胃腸道內(nèi)還是腸道外都具有重要作用，因此完全消除其合成并非良策；選擇性減少5-HT 釋放和生物利用度從而改善胃腸功能紊亂、限制炎癥等，將是一個(gè)比較好的策略。靶向調(diào)節(jié)5-HT 釋放和EC 細(xì)胞水平的信號(hào)將成為胃腸功能紊亂及炎癥性腸病的潛在治療策略。目前5-HT3受體已經(jīng)成為治療惡心、嘔吐、IBS和抑郁癥的靶點(diǎn)［38］。臨床試驗(yàn)顯示5-HT 拮抗劑治療腹瀉型IBS 具有較好的效果［39-40］。

我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然初步提示機(jī)械敏感性離子通道Piezo1 參與慢性WAS 誘導(dǎo)的IBS 大鼠的內(nèi)臟高敏感性和腸道5-HT 代謝紊亂，但尚需更多嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑隗w動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Piezo1 在IBS發(fā)病機(jī)制中的作用，并且動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果不能簡(jiǎn)單推廣到人體，尚需與臨床試驗(yàn)資料緊密結(jié)合、謹(jǐn)慎分析。由于胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞散在分布在整個(gè)胃腸道，并且胃腸道細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)及腸道免疫熒光染色技術(shù)的限制，對(duì)于胃腸道上皮細(xì)胞的進(jìn)一步研究受到極大制約。采用基因工程技術(shù)如CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic re?peats）或組織特異性基因敲除動(dòng)物來(lái)研究Piezo 通道在胃腸道功能紊亂及相關(guān)疾病中的作用及機(jī)制將是下一步比較適合的方法和策略。