葉酸代謝障礙與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性研究進(jìn)展

袁碧波，王秋霞，李增彥，馬艷紅

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是女性妊娠常見的并發(fā)癥之一，不同地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)有所不同，美國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)是2 次或2 次以上的自然流產(chǎn)[1]；英國(guó)則定義為與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3 次或3次以上并且在妊娠24 周前的胎兒丟失[2]；而根據(jù)我國(guó)2016 年專家共識(shí)將RSA 定義為3 次或3 次以上在妊娠28 周之前的胎兒丟失，但連續(xù)2 次流產(chǎn)應(yīng)給予重視和評(píng)估[3]。其病因復(fù)雜，已知的病因包括遺傳、解剖、感染、內(nèi)分泌、免疫等因素，而高達(dá)50%～75%的患者病因尚不明確[4]。近年來(lái)眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)葉酸代謝可能與RSA 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，現(xiàn)綜述葉酸代謝異常與RSA 的相關(guān)關(guān)系。

1 葉酸的代謝通路及生理作用

葉酸又稱蝶酰谷氨酸，是B 族維生素的一種，也稱維生素B9，由對(duì)氨基苯甲酸、蝶呤啶、谷氨酸等組成，是人體所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，人體內(nèi)不能合成葉酸，需外源性獲取。其作為一碳單位的重要載體，是一碳單位生物合成和表觀遺傳過(guò)程的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要參與了DNA 甲基化和DNA 合成。葉酸代謝過(guò)程[5]（如圖1 所示）為：葉酸在還原葉酸載體1（RFC1）轉(zhuǎn)運(yùn)下進(jìn)入細(xì)胞中，在二氫葉酸（DHF）還原酶作用下形成DHF，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為具有生理活性的四氫葉酸（THF），在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，THF 活化為5，10-亞甲基四氫葉酸（5，10-MTHF），5，10-MTHF在亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）作用下轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸（5-MTHF），其后5-MTHF 在維生素B12 依賴性蛋氨酸合成酶（MTR）作用下將一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移給同型半胱氨酸（HCY）后生成THF 和蛋氨酸，蛋氨酸在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（MAT）催化下形成S-腺苷蛋氨酸（SAM）。作為甲基的載體SAM 是DNA 甲基化和蛋白質(zhì)合成等過(guò)程的重要物質(zhì)，其甲基轉(zhuǎn)移后轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸（SAH），經(jīng)過(guò)水解生成HCY 和腺苷，此后HCY 有3 個(gè)去向[6]：①繼續(xù)通過(guò)蛋氨酸循環(huán)參與葉酸代謝過(guò)程；②膽堿和甜菜堿的分解代謝；③轉(zhuǎn)硫途徑：經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)硫基化后和絲氨酸在胱硫醚β 合成酶（CBS）催化下縮合成胱硫醚，進(jìn)而可形成谷胱甘肽（GSH）。此外，葉酸還參與尿嘧啶脫氧核苷酸（dUMP）到胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP）合成過(guò)程，葉酸缺乏時(shí)可導(dǎo)致dTMP 合成受阻。因此，葉酸從頭參與了DNA 和RNA 前體的合成，是核酸合成和DNA 修復(fù)的重要物質(zhì)，葉酸代謝障礙可影響DNA 甲基化水平和干擾DNA 合成。見圖1。

圖1 葉酸代謝途徑[5]

2 葉酸代謝障礙與RSA 的關(guān)系

葉酸代謝途徑中需要多種酶的參與，酶活性的改變可影響葉酸代謝過(guò)程，其中關(guān)鍵酶MTHFR 和MTRR 等基因突變可引起酶活性的改變，導(dǎo)致葉酸代謝異常，造成葉酸水平降低，HCY 水平上升[7-8]。

2.1 葉酸代謝酶基因多態(tài)性與葉酸代謝障礙

2.1.1 MTHFR 基因多態(tài)性 MTHFR 的編碼基因位于染色體1P36.3，最常見的突變位點(diǎn)是677C→T（野生型CC、雜合型CT、突變型TT）和1298A→C（AA、AC、CC 型）。Frosst 等[9]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 677 C→T位點(diǎn)突變可導(dǎo)致不同程度的酶活性和耐熱性降低，在46 ℃加熱后CC 型、CT 型、TT 型酶的活性分別為67%、59%、22%，其酶活性降低導(dǎo)致葉酸濃度降低和血漿中HCY 濃度升高；van der Put 等[10]發(fā)現(xiàn)MTHFR 1298A→C 位點(diǎn)純合突變可使MTHFR 的酶活性降低進(jìn)而影響葉酸代謝，且MTHFR 1298（A→C）位點(diǎn)突變對(duì)葉酸代謝的影響弱于677（C→T）位點(diǎn)突變，但在葉酸攝入低或葉酸需求增加時(shí)如妊娠時(shí)，該位點(diǎn)突變臨床應(yīng)重視。Crider 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，增補(bǔ)不同劑量的葉酸后檢測(cè)血漿葉酸濃度發(fā)現(xiàn)，3 種MTHFR基因型的葉酸濃度保持以下趨勢(shì)：CC＞CT＞TT，MTHFR C677T 基因型與葉酸濃度和HCY 濃度顯著相關(guān)，可作為增補(bǔ)葉酸的預(yù)測(cè)因子。這進(jìn)一步驗(yàn)證了葉酸基因型的多態(tài)性可通過(guò)影響酶活性造成葉酸水平降低和HCY 水平升高。

此外，研究發(fā)現(xiàn)葉酸基因型多態(tài)性具有種族和地域差異性，MTHFR C677T 基因型在我國(guó)人群中所占比例為CC 型17.4%，CT 型47.5%，TT 型35.1%[11]，MTHFR C677T 純合子在非洲以外黑人中的分布頻率為1%～2%，而在意大利和西班牙裔美國(guó)人中的分布頻率為20%或更高[12]。在東亞人群[包括中國(guó)、日本、朝鮮，TT 基因型OR=2.11（P＜0.000 4），T 等位基因OR=1.53（P＜0.000 1）]和混合人群[包括印度、巴西、巴林、埃及和墨西哥，TT 基因型OR=3.47（P＜0.000 1），T 等位基因OR=1.80（P＜0.027）]中發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 和不明原因的RSA 之間存在顯著相關(guān)性，但是在高加索人群中并未發(fā)現(xiàn)兩者之間的關(guān)聯(lián)，且該研究發(fā)現(xiàn)MTHFR A1298C 與RSA 之間無(wú)相關(guān)關(guān)系[13]；劉宇巖等[14]通過(guò)對(duì)22 篇文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)女性人群中，MTHFR 基因多態(tài)性與原因不明的RSA 之間存在關(guān)聯(lián)，但在其他國(guó)家并未發(fā)現(xiàn)兩者存在相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)論不一致可能與種族和地域差異性有關(guān)。

2.1.2 MTRR 基因多態(tài)性 MTRR 的編碼基因位于5P15.2～5P15.3，常見的突變位點(diǎn)是66A→G（AA、AG、GG 型）。MTRR 通過(guò)參與MTR 的還原活化間接參與在HCY 向蛋氨酸轉(zhuǎn)化的過(guò)程，已有研究發(fā)現(xiàn)MTRR A66G 突變型在激活MTR 活性方面較野生型低，兩者相差3～4 倍[15]，MTRR A66G 位點(diǎn)突變導(dǎo)致HCY 水平升高從而增加血栓形成風(fēng)險(xiǎn)；王偉華等[16]發(fā)現(xiàn)，與AA 型相比，AG 型和GG 型高同型半胱氨酸血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別高1.98 倍和3.92 倍。因此MTRR 基因多態(tài)性通過(guò)影響MTR 活性可引起HCY轉(zhuǎn)化過(guò)程異常造成HCY 蓄積，進(jìn)而與心血管疾病、神經(jīng)管缺陷、先心病等發(fā)生相關(guān)[17-18]。

總之，葉酸代謝途徑關(guān)鍵酶的基因位點(diǎn)突變可通過(guò)影響相關(guān)酶活性造成葉酸代謝異常進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，且關(guān)鍵酶基因多態(tài)性有種族或地域差異性。

2.2 葉酸基因多態(tài)性與RSA 2004 年有學(xué)者提出RSA 與MTHFR 基因位點(diǎn)突變有關(guān)[19]。秦奇等[20]在分析葉酸代謝酶與胚胎停育的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 和MTRR A66G 基因突變與胚胎停育相關(guān)。在我國(guó)人群中多個(gè)學(xué)者的研究證實(shí)，葉酸基因多態(tài)性與RSA 存在相關(guān)性：Chen 等[21]進(jìn)行Meta 分析發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人群中MTHFR C677T 基因型與復(fù)發(fā)性妊娠丟失有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)MTHFR A1298C 的基因突變與其有關(guān)。趙雪杰等[22]通過(guò)對(duì)201 例有不良孕產(chǎn)史者和321 例無(wú)不良孕產(chǎn)史者進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，有不良孕產(chǎn)史者的MTHFR 基因突變純合型（C667T位點(diǎn)TT 型和A1298C 位點(diǎn)CC 型）頻率高于無(wú)不良孕產(chǎn)史者（x2分別為13.00 和5.09，均P＜0.05），提示MTHFR 基因突變可能會(huì)增加不良孕產(chǎn)史的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

謝曉媛等[23]研究發(fā)現(xiàn)葉酸代謝酶編碼基因突變（MTHFR C677T）可造成RSA 風(fēng)險(xiǎn)增加，其致病機(jī)制與酶活性改變相關(guān)；王連等[24]和唐黛麗等[25]研究發(fā)現(xiàn)，RSA 與葉酸代謝酶基因型多態(tài)性相關(guān)，可能與葉酸代謝障礙導(dǎo)致HCY 水平升高有關(guān)。Lin 等[26]通過(guò)對(duì)403 例RSA 患者和342 例健康對(duì)照者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，RSA 患者的血清HCY 和低密度脂蛋白水平均升高，葉酸水平降低，其發(fā)生可能與葉酸代謝酶基因多態(tài)性有關(guān)。眾多學(xué)者的研究表明，葉酸基因多態(tài)性可能通過(guò)影響酶活性導(dǎo)致葉酸代謝障礙，進(jìn)而影響葉酸、HCY、低密度脂蛋白水平等，造成RSA 風(fēng)險(xiǎn)增加，進(jìn)一步證實(shí)了葉酸基因多態(tài)性與RSA 相關(guān)性。

Mazokopakis 等[27]通過(guò)Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)MTHFR C＞T 核苷酸的改變使妊娠丟失的風(fēng)險(xiǎn)增加至4 倍，建議妊娠婦女適當(dāng)增補(bǔ)葉酸避免葉酸缺乏造成不良影響。熊雯等[28]和馬慶榮[29]的研究均發(fā)現(xiàn)RSA 患者的葉酸水平低于正常女性，而血清HCY 水平升高，經(jīng)過(guò)正規(guī)葉酸干預(yù)后可調(diào)節(jié)葉酸代謝情況，降低HCY 水平，有利于改善妊娠結(jié)局和減少妊娠并發(fā)癥的發(fā)生。

總之，葉酸基因多態(tài)性可導(dǎo)致葉酸代謝異常從而增加RSA 風(fēng)險(xiǎn)，而通過(guò)葉酸干預(yù)可改善妊娠結(jié)局，減少RSA 發(fā)生。但也有研究表明未發(fā)現(xiàn)葉酸代謝酶基因多態(tài)性與RSA 存在關(guān)聯(lián)[30]，結(jié)果矛盾的原因除了有地域、種族的差異性，還可能與各地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)不同導(dǎo)致納入研究的RSA 患者的流產(chǎn)次數(shù)不同相關(guān)。

3 致病機(jī)制

目前，葉酸代謝障礙與RSA 的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議，大量研究表明，我國(guó)人群中葉酸代謝障礙與RSA風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，其發(fā)生機(jī)制可能有以下2 個(gè)方面。

3.1 影響DNA 合成和甲基化，造成染色體的部分分離異常 葉酸代謝障礙可造成dTMP 合成受阻和DNA 甲基化水平降低。dTMP 合成受阻可導(dǎo)致dUMP在DNA 合成過(guò)程中錯(cuò)誤摻入增加，造成DNA 在復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中發(fā)生DNA 鏈斷裂甚至染色體的斷裂，影響基因組的穩(wěn)定性[31]。甲基化修飾在基因的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)基因表達(dá)過(guò)程中起重要的作用，甲基化水平可通過(guò)影響著絲粒異染色質(zhì)凝聚水平導(dǎo)致部分染色體分離異常，造成非整倍體染色體異常[32]。James等[33]提出葉酸代謝異常引起的DNA 低甲基化可能是導(dǎo)致唐氏綜合征（DS）發(fā)生的高危因素。已有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中葉酸缺乏與17 號(hào)和21 號(hào)染色體非整倍體發(fā)生相關(guān)[34]，Sadiq 等[35]研究發(fā)現(xiàn)DS 和葉酸代謝酶MTHFR C677T 的基因型有關(guān)，Kaur 等[36]通過(guò)對(duì)37 篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR 677 C→T 是DS 出生的主要危險(xiǎn)因素。此外多項(xiàng)研究在中國(guó)和土耳其等人群中發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T 的基因多態(tài)性可增加子代DS 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[37-39]。總之，葉酸代謝障礙可能通過(guò)影響DNA 甲基化與非整倍染色體形成相關(guān)，染色體的結(jié)構(gòu)或數(shù)目的異?？蓪?dǎo)致妊娠早期流產(chǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致RSA 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。但葉酸代謝障礙與DS 的相關(guān)關(guān)系尚存爭(zhēng)議，也有研究表明，葉酸MTHFR 基因多態(tài)性并不增加子代DS 的風(fēng)險(xiǎn)[40-42]，其可能存在地域或種族差異性，葉酸代謝障礙是否通過(guò)影響染色體的非整倍體形成與RSA 發(fā)病相關(guān)尚需要多中心、大樣本的臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 HCY 升高致胚胎發(fā)育異常 葉酸代謝障礙可引起HCY 輕、中度升高，HCY 水平升高是血管疾病和內(nèi)皮功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、刺激平滑肌細(xì)胞增殖、脂代謝異常、氧化應(yīng)激、抑制硫化氫（H2S）生成等多種途徑損傷血管，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生；HCY 還可直接激活凝血因子（Ⅹ、Ⅻ、Ⅴ因子），導(dǎo)致蛋白C 和其活化的輔助因子血栓調(diào)節(jié)蛋白活性被抑制，從而引起凝血酶和Ⅴa、Ⅷa 滅活減少、血栓素A2 合成、血小板的聚集性和黏附性增加，造成凝血功能異常[43-44]。大量研究表明HCY 可通過(guò)損傷胎盤血管和胎盤血管血栓形成引起胎盤供血不足和直接對(duì)胚胎的毒性作用，最終可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常造成不良妊娠結(jié)局。女性在妊娠期間HCY 水平較妊娠前相比明顯降低，如妊娠期其輕度升高可引起母體和胎兒損傷造成不良妊娠結(jié)局。Eskes 等[45]對(duì)165 例有胎盤血管病變的妊娠婦女和139 例正常妊娠婦女進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，HCY 水平升高增加胎盤病變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，HCY 水平可通過(guò)維生素和葉酸來(lái)調(diào)節(jié)。李孟蘭等[46]研究發(fā)現(xiàn)RSA 患者較正常妊娠婦女和正常未妊娠婦女的血漿HCY 水平升高，且高同型半胱氨酸血癥發(fā)生率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同時(shí)高HCY 水平可使RSA 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加3 倍（OR=4.095）。趙宗霞等[47]研究結(jié)果顯示，RSA 患者中的HCY 陽(yáng)性者較正常分娩婦女明顯增多（P＜0.05）且RSA 患者的抗凝血酶Ⅲ活性明顯降低（P＜0.01），推測(cè)HCY 可能通過(guò)破壞凝血功能造成微血栓形成從而導(dǎo)致RSA。周艷荷等[48]認(rèn)為HCY 升高與RSA 密切相關(guān)，其機(jī)制可能與凝血異常有關(guān)，而造成HCY 升高的主要原因?yàn)槿~酸缺乏。因此葉酸缺乏可造成HCY 升高引起凝血功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致RSA 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上所述，葉酸代謝障礙可能增加RSA 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其原因可能與其造成染色體非整倍異常和HCY升高致胚胎發(fā)育異常相關(guān)，適當(dāng)增補(bǔ)葉酸可調(diào)節(jié)葉酸和HCY 水平，可防治葉酸缺乏性相關(guān)疾病，如神經(jīng)管缺陷等，且在防治RSA 上起一定的作用。目前RSA 病因上的研究已取得很大的進(jìn)展，但具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證其關(guān)系，有助于RSA 的診斷、治療和預(yù)防。