藏藥四臣止咳顆粒的指紋圖譜研究

覃柳瑩，蔡夢(mèng)如，姚宇，白杰，吳慧敏，張志勤，張碩峰，倪健，格桑頓珠，尹興斌*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，拉薩 850000）

藏藥四臣止咳顆粒來(lái)源于藏醫(yī)理論經(jīng)典古方加之名老藏醫(yī)藥專家多年經(jīng)驗(yàn)方而成，由螃蟹甲、豬毛蒿、甘草、巖白菜4 味藥組成，具有清熱解毒、止咳化痰的功效。方中甘草的甘草酸、甘草次酸等活性成分具有抗病毒、抗炎殺菌的作用[1]；豬毛蒿中的綠原酸等有機(jī)酸類成分是抗菌、抗病毒的主要活性成分[2]；螃蟹甲的總皂苷類成分有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用[3]；巖白菜中的巖白菜素具有極強(qiáng)的止咳作用[4]。研究表明，四臣止咳顆粒對(duì)濃氨水、二氧化硫、枸櫞酸等對(duì)呼吸道刺激引起的咳嗽有顯著的抑制作用，亦能抑制二甲苯、角叉菜膠誘發(fā)的急性炎癥[5]。目前關(guān)于四臣止咳顆粒的研究多為制備工藝優(yōu)化及藥效作用評(píng)價(jià)[6-8]，關(guān)于其質(zhì)量控制研究較少。中藥復(fù)方具有化學(xué)成分復(fù)雜、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，藥效作用的發(fā)揮往往是多種成分共同作用的結(jié)果，因此對(duì)其質(zhì)量控制需要更全面的評(píng)價(jià)方法。指紋圖譜具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，能夠充分整合并反映中藥復(fù)方的化學(xué)成分信息，是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面評(píng)價(jià)研究的重要方法[9]。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了四臣止咳顆粒的指紋圖譜，通過(guò)多成分控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保產(chǎn)品的安全有效[10]。

1 儀器與試藥

MS105 DU 型電子分析天平（Mettler-Toledo GmbH）；YP 5002 型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；SB-5200 DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SPD-M20A 型高效液相色譜儀（島津）。

甘草苷（批號(hào)：111610-201607， 純度：93.1%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-202021，純度：96.2%）、綠原酸（批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%）、巖白菜素（批號(hào)：111532-201604，純度：94.1%）、熊果苷（批號(hào)：111951-201301，純度：99.7%）、沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201906，純度：91.5%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；隱綠原酸（批號(hào)：B21587，純度≥98%）、8-O-乙酰山梔苷甲酯（批號(hào)：B21858，純度≥98%）對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司）；甘草（批號(hào)：20180928，本草方源有限公司），巖白菜、豬毛蒿、螃蟹甲均由西藏藏醫(yī)藥大學(xué)提供，3 種藥材由格桑頓珠副教授分別鑒定為虎耳草科植物巖白菜的干燥根莖、菊科植物濱蒿的干燥地上部分及唇形科植物螃蟹甲的干燥塊根。11 批四臣止咳顆粒樣品為自制樣品，由不同批次提取制備的干膏粉與糊精經(jīng)不同操作人員進(jìn)行濕法制粒而成（編號(hào)：S1 ～S11）。

后期時(shí)，因經(jīng)歷與北方異族作戰(zhàn)，盟中人數(shù)驟然減少，風(fēng)氣也更為自由。盟主時(shí)常一年輪換一次，也不必特意召開比武大會(huì)。而是由現(xiàn)任盟主與選好的下任盟主對(duì)打一次，儀式性居多，其結(jié)果必定是現(xiàn)任盟主（或真或假的）落敗，隨后新任盟主上任。

2 方法結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～16 min，4%～8%A；16 ～30 min，8% ～9%A；30 ～50 min，9% ～16%A；50 ～70 min，16% ～17%A；70 ～73 min，17% ～20%A；73 ～93 min，20% ～28%A；93 ～105 min，28% ～43%A；105 ～120 min，43%～50%A），流速0.8 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫20℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品S1，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，以7 號(hào)峰為參照，經(jīng)計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品S1，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以7 號(hào)峰為參照，經(jīng)計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2 溶液制備

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 精密稱定甘草苷、甘草酸銨、綠原酸、隱綠原酸、山梔苷甲酯、巖白菜素、熊果苷、沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成含甘草苷48.41 μg·mL－1、甘草酸銨31.75 μg·mL－1、巖白菜素88.45 μg·mL－1、綠原酸44.53 μg·mL－1、熊果苷103.69 μg·mL－1、沒(méi)食子酸57.65 μg·mL－1、隱綠原酸60.76 μg·mL－1、8-O-乙酰山梔苷甲酯43.12 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.1 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50%甲醇30 mL，40 kHz 超聲提取30 min，放冷，加50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

一位社工負(fù)責(zé)全職照看結(jié)核病人的工作，在結(jié)核病房工作的其他社工負(fù)責(zé)把所有的結(jié)核病人都轉(zhuǎn)介給她。她參加結(jié)核病門診，查看所有由醫(yī)生轉(zhuǎn)介的結(jié)核病人，并盡力安排他們?nèi)ラT診治療，或是住院，或是住療養(yǎng)院，或是回家休養(yǎng)。無(wú)論如何，治療都是合理的。結(jié)核病人所需的治療方式，是醫(yī)生和社工根據(jù)對(duì)患者的病情、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)狀況的慎重考慮而共同決定的。服務(wù)重點(diǎn)是照顧處于早期階段的結(jié)核病患者，以及有足夠收入以完成整個(gè)治療過(guò)程的病人。

James說(shuō)在后期需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整?！坝肔ightroom適當(dāng)提升清晰度，給圖像帶來(lái)了沖擊力。用Photoshop對(duì)邊緣地區(qū)進(jìn)行選擇性模糊處理，可讓觀眾的注意力從彩色涂鴉轉(zhuǎn)移到路虎衛(wèi)士車頭的格柵設(shè)計(jì)上?！?/p>

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取樣品S1，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。以峰面積較大，分離度好的7 號(hào)峰為參照，經(jīng)計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方比例分別稱取各味藥陰性提取物粉末，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

綜上所述，糖尿病對(duì)心肌不同時(shí)間點(diǎn)上時(shí)Bmal1、Per2的表達(dá)產(chǎn)生影響，糖尿病病理狀態(tài)使時(shí)鐘基因晝夜表達(dá)節(jié)律發(fā)生異常，其可能是糖尿病心肌損傷的重要內(nèi)源性機(jī)制。

兩種焊接工藝焊縫的金相組織如圖7a所示，其中間部分是針狀鐵素體，周圍是晶界鐵素體。自動(dòng)焊焊縫中的組織比手工焊分布更加均勻，晶粒更加細(xì)小。

2.2.3 單味藥供試品溶液 按處方比例分別稱取各單味藥提取物及各單味藥飲片粉末，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

取11 批（S1 ～S11）顆粒樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將得到的S1 ～S11 圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》進(jìn)行分析，以S1 圖譜作為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.3 min，經(jīng)多點(diǎn)校正后全峰譜匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，見圖1。根據(jù)所檢測(cè)的圖譜，選擇穩(wěn)定性好、吸收較強(qiáng)、特征明顯的色譜峰作為共有峰進(jìn)行標(biāo)定，確定了25 個(gè)共有峰，選擇峰面積較大、分離度較好的7 號(hào)峰作為參照峰。11 批四臣止咳顆粒指紋圖譜見圖2。

圖1 四臣止咳顆粒對(duì)照指紋圖譜Fig 1 HPLC reference fingerprint of Sichen Zhike granules

圖2 11 批四臣止咳顆粒樣品的HPLC 指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint of 11 batches of Sichen Zhike granules

2.5 共有峰的歸屬與指認(rèn)

分別取各單味藥供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖（見圖3 ～6）。結(jié)果顯示，5、7、8、11、16、17、18、19 號(hào)峰來(lái)源于豬毛蒿，1、3、6、13 號(hào)峰來(lái)源于巖白菜，9、12、14 號(hào)峰來(lái)源于螃蟹甲，15、20、21、22、23、24、25 號(hào)峰來(lái)源于甘草，其中2 號(hào)峰共同來(lái)源于豬毛蒿和甘草，4 號(hào)峰共同來(lái)源于豬毛蒿、巖白菜和螃蟹甲，10 號(hào)峰共同來(lái)源于豬毛蒿、巖白菜和甘草。通過(guò)與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)8 個(gè)指標(biāo)成分，1 號(hào)峰為熊果苷、3 號(hào)峰為沒(méi)食子酸、6 號(hào)峰為巖白菜素、7 號(hào)峰為綠原酸、8 號(hào)峰為隱綠原酸、12 號(hào)峰為8-O-乙酰山梔苷甲酯、15 號(hào)峰為甘草苷、24 號(hào)峰為甘草酸銨，見圖7。

圖3 豬毛蒿單味藥、陰性樣品溶液與供試品溶液HPLC 指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprint of single medicine of Artemisia scoparia，negative solution and sample solution

圖4 巖白菜單味藥、陰性樣品溶液與供試品溶液HPLC 指紋圖譜Fig 4 HPLC fingerprint of single medicine of Bergenia purpurascens，negative solution and sample solution

圖5 螃蟹甲單味藥、陰性樣品溶液與供試品溶液HPLC 指紋圖譜Fig 5 HPLC fingerprint of single medicine of Phlomis younghusbandii，negative solution and sample solution

圖6 甘草單味藥、陰性樣品溶液與供試品溶液HPLC 指紋圖譜Fig 6 HPLC fingerprint of single medicine of Glycyrrhiza uralensis，negative solution and sample solution

2.6 相似度分析

圖7 混合對(duì)照品溶液與供試品溶液HPLC 指紋圖譜Fig 7 HPLC fingerprint of mixed reference substances and sample solution

對(duì)11 批樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果表明11 批樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均≥0.99，各批次間樣品相似度均＞0.97，見表1。說(shuō)明四臣止咳顆粒制劑工藝穩(wěn)定，不同批次間化學(xué)成分組成差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.7 化學(xué)模式識(shí)別

2.7.1 聚類分析 運(yùn)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以25 個(gè)共有色譜峰的峰面積數(shù)據(jù)為變量，Z 標(biāo)準(zhǔn)化，以平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用Ward 法對(duì)11 批四臣止咳顆粒進(jìn)行系統(tǒng)聚類，見圖8。結(jié)果顯示，類間距為10～25時(shí)可分為兩類，聚類結(jié)果與相似度結(jié)果相符，表明四臣止咳顆粒的制劑工藝較為穩(wěn)定，各批次間差異較小。

表1 11 批四臣止咳顆粒相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表Tab 1 Similarity evaluation of HPLC fingerprint for 11 batches of Sichen Zhike granules

圖8 11 批四臣止咳顆粒樣品聚類分析樹狀圖Fig 8 Dendrogram of clustering analysis of 11 batches of Sichen Zhike granules

2.7.2 主成分分析 運(yùn)用SAS 8.2 軟件分析，以25 個(gè)共有峰峰面積為變量，特征根＞1 為標(biāo)準(zhǔn)，提取到5 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率為93.100%，見表2。根據(jù)主成分載荷矩陣，見表3，確定第一主成分中載荷量較大的7 個(gè)變量，分別為15、12、6、7、22、24、1 號(hào)峰，表明第一主成分主要反映了這些成分的信息，其中15 號(hào)峰為甘草苷，12 號(hào)峰為8-O-乙酰山梔苷甲酯，6 號(hào)峰為巖白菜素，7 號(hào)峰為綠原酸，24 號(hào)峰為甘草酸銨，1 號(hào)峰為熊果苷；同理，第二主成分主要反映了18、5、8、2、20、16 號(hào)峰的信息，其中8 號(hào)峰為隱綠原酸；第三主成分主要反映了21、25、3、14、9、13、11、17、19 號(hào)峰的信息，其中3 號(hào)峰為沒(méi)食子酸。以5 個(gè)主成分（Z1～Z5）所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率占所提取主成分的累積貢獻(xiàn)率的比例作為權(quán)重（即各主成分系數(shù)＝各主成分方差貢獻(xiàn)率/5 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率），計(jì)算主成分綜合模型為：Y＝0.3770Z1＋0.3188Z2＋0.1696Z3＋0.0844Z4＋0.0502Z5，通過(guò)模型計(jì)算各樣本綜合得分并進(jìn)行排序，初步對(duì)11 批樣品進(jìn)行優(yōu)劣分析，綜合得分（Y）高為好，11 批樣品中以S2 批次為最優(yōu)。同時(shí)，可通過(guò)各批次的各主成分得分比較分析各批次間的主要成分差異，結(jié)果見表4。

表2 11 批四臣止咳顆粒樣品指紋圖譜共有峰主成分分析結(jié)果Tab 2 Principal component analysis of common peaks in fingerprints of 11 batches of Sichen Zhike granule

表3 11 批四臣止咳顆粒樣品指紋圖譜共有峰主成分載荷矩陣Tab 3 Principal component loading matrix of common peaks in fingerprints of 11 batches of Sichen Zhike granule

3 討論與結(jié)論

研究考察了以甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)對(duì)指紋圖譜的分離情況，以乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)分離情況最佳，峰形較好。分別考察了50%甲醇在30、45、60 min 超聲提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果在45 min 及60 min 時(shí)提取峰數(shù)量及峰面積并未有顯著增加，故選擇50%甲醇超聲30 min 提取。同時(shí)比較了流速在0.6、0.8、1.0 mL·min－1時(shí)的分離情況，結(jié)果在0.8 mL·min－1時(shí)色譜峰分離情況較好。通過(guò)DAD 檢測(cè)器在190 ～400 nm 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在254 nm 波長(zhǎng)處色譜峰較多，可代表的信息較全面，因此選擇254 nm 作為指紋圖譜的采集波長(zhǎng)。

表4 11 批四臣止咳顆粒樣品主成分得分及綜合得分排序Tab 4 Principal component score and comprehensive score ranking of 11 batches of Sichen Zhike granule

在指紋圖譜測(cè)定過(guò)程中，通過(guò)對(duì)比生藥材與提取物的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，豬毛蒿生藥中綠原酸含量較高，隱綠原酸含量很低，而經(jīng)過(guò)工藝提取后，綠原酸含量降低，隱綠原酸含量大幅升高。豬毛蒿中主要含有以綠原酸為代表的酚酸類成分，通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知，綠原酸在提取過(guò)程中因受熱水解可轉(zhuǎn)化為新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸等衍生物[11]。因此，在四臣止咳顆粒的生產(chǎn)及質(zhì)量控制中，可重點(diǎn)關(guān)注水溶性酚酸類成分的變化，能夠更全面地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究首次建立了四臣止咳顆粒HPLC 指紋圖譜，標(biāo)定25 個(gè)共有峰，指認(rèn)8 個(gè)色譜峰。該方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好。采用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)不同批次四臣止咳顆粒進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果不同批次四臣止咳顆?；瘜W(xué)成分組成上差異較小，質(zhì)量較穩(wěn)定?；瘜W(xué)模式識(shí)別是化學(xué)計(jì)量學(xué)的重要組成部分，也是篩選中藥質(zhì)量標(biāo)志物的重要方法，在中藥的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)研究中具有重要意義[12]。研究采用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)11批顆粒樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類和主成分分析，結(jié)果將樣品聚為兩類，提取出5 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.100%，已指認(rèn)成分有甘草苷、8-O-乙酰山梔苷甲酯、巖白菜素、綠原酸、甘草酸銨、熊果苷、隱綠原酸、沒(méi)食子酸。本研究結(jié)果可為四臣止咳顆粒的質(zhì)量控制提供更全面的參考。