超聲引導(dǎo)下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對(duì)全麻下行乳腺癌手術(shù)患者免疫功能的影響

崔秀玲 劉萍 趙曉琛 于麗麗 趙浩晨 繳寶杰

乳腺癌是全世界范圍內(nèi)的一種常見(jiàn)癌癥，是女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤[1]。盡管手術(shù)旨在消除大多數(shù)腫瘤組織，但癌細(xì)胞仍可能擴(kuò)散至血液和淋巴循環(huán)系統(tǒng)[2]，這可能導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)，尤其是在手術(shù)和麻醉劑誘導(dǎo)的免疫抑制下[3]。因此，術(shù)后免疫力的提高對(duì)患者的生存至關(guān)重要。胸神經(jīng)阻滯通過(guò)在手術(shù)過(guò)程中阻斷胸神經(jīng)和肋間神經(jīng)而表現(xiàn)出相對(duì)較少的并發(fā)癥[4,5]。與Ⅰ型胸神經(jīng)阻滯相比，Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯增加了肋間神經(jīng)外側(cè)支的二次注射[6]。先前研究報(bào)道，胸神經(jīng)阻滯可以達(dá)到更好的鎮(zhèn)痛效果[7]，減少手術(shù)期間阿片類(lèi)藥物如瑞芬太尼和芬太尼的使用，并通過(guò)阻斷周?chē)窠?jīng)以減少術(shù)后的慢性疼痛[8]。手術(shù)和麻醉都會(huì)對(duì)免疫產(chǎn)生不利影響[9,10]。既往研究表明，手術(shù)應(yīng)激與血管生成和轉(zhuǎn)移以及先天免疫和細(xì)胞免疫受到抑制相關(guān)[3]。NK細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分，有助于保護(hù)機(jī)體免受腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散[11,12]。因此，NK細(xì)胞的丟失可能潛在地提高了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[13]。胰腺小鼠模型的證據(jù)表明，NK細(xì)胞的丟失促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展[14]。曲妥珠單抗(trastuzumab)是一種常用的乳腺癌藥物，是一種單克隆抗體，可選擇性靶向作用于Her2。Her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的裂解能力主要取決于NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)，因此NK細(xì)胞在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。關(guān)于Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯，我們旨在研究其是否能夠改善乳腺癌術(shù)后NK細(xì)胞的增殖和殺傷活性。除NK細(xì)胞外，也評(píng)估并比較了患者的其他免疫細(xì)胞，包括自然殺傷T(NKT)細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)滄州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書(shū)。本研究共納入232位被診斷為乳腺癌且經(jīng)美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(ASA)身體狀況評(píng)分為Ⅰ和Ⅱ級(jí)的患者。所有登記的參與者都準(zhǔn)備接受保乳手術(shù)/改良根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 18歲以下；(2)既往手術(shù)史和腫瘤史；(3)其他類(lèi)型腫瘤；(4)心臟病、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他疾病史；(5)凝血障礙或?qū)κ中g(shù)藥物過(guò)敏；(6)最近接受放療或化療(<8周)；(7)最近使用類(lèi)固醇或阿片類(lèi)藥物，酒精或其他非法藥物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)排除后，納入196例患者。根據(jù)計(jì)算機(jī)生成的一組隨機(jī)數(shù)字將這些患者分為2組：?jiǎn)渭內(nèi)砺樽斫M(G組)和全身麻醉下的Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯組(PG組)。住院期間，所有參與者都接受了合適的麻醉和手術(shù)。手術(shù)組和護(hù)理組對(duì)分組情況不知情，且所有患者均由同一名麻醉師麻醉。

1.2 麻醉方法 患者均接受利多卡因(河北天成藥業(yè)股份有限公司，1 mg/kg)，異丙酚(四川國(guó)瑞藥業(yè))和瑞芬太尼(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)的麻醉誘導(dǎo)和維持。調(diào)整瑞芬太尼劑量以使BIS值保持在40～60。采用靶控輸注(TCI)泵(Orchestra；Fresenius-Kabi，德國(guó))，分別使用Schnider等[15,16]的藥代動(dòng)力學(xué)模型來(lái)計(jì)算丙泊酚和瑞芬太尼的用量。PG組在全麻誘導(dǎo)后根據(jù)已發(fā)表的方法進(jìn)行超聲引導(dǎo)下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯[17]。首先，在鎖骨外側(cè)三分之一處放置超聲探頭，以確定腋窩靜脈和動(dòng)脈。然后將探頭移至胸大肌和小肌之間的位置。之后，在超聲引導(dǎo)下，在胸大肌和胸小肌之間斜置一根超聲針。然后，注射羅哌卡因(齊魯制藥有限公司，0.5%，10 ml)。然后將探針從第一根肋骨移到第三根肋骨，到達(dá)前鋸肌。推進(jìn)針直到其尖端到達(dá)Pmm和SAM之間的潛在空間，將羅哌卡因(0.5%，20 ml)注入該區(qū)域。術(shù)中監(jiān)測(cè)心電圖、無(wú)創(chuàng)血壓、脈搏血氧飽和度、體溫、雙譜指數(shù)(40～60，BIS vista monitor revision 3.0；Aspect Medical Systems，USA)。當(dāng)雙譜指數(shù)>60時(shí)，給予異丙酚0.5 μg/kg(間隔為1 min或更長(zhǎng)時(shí)間)靜脈注射。當(dāng)心率降至<50次/min時(shí)，靜脈注射阿托品0.5 mg。手術(shù)后，將確認(rèn)自發(fā)呼吸和意識(shí)恢復(fù)的患者移至術(shù)后重癥監(jiān)護(hù)室，進(jìn)行接下來(lái)的24 h監(jiān)測(cè)。

1.3 血樣采集 手術(shù)24 h后，將患者的血液樣本收集在肝素管中以進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離，并用乙二胺四乙酸管進(jìn)行細(xì)胞因子評(píng)估。采用Ficoll-Paque(GE Healthcare，瑞典)密度梯度離心法分離PBMC[18]，并冷凍于含10%二甲基亞砜(Sigma-Aldrich，美國(guó))的熱滅活人AB血清(Sigma-Aldrich，美國(guó))中。

1.3.1 NK細(xì)胞分離:根據(jù)制造商提供的流式細(xì)胞術(shù)方案，從抗CD56結(jié)合微球(英國(guó)MiltenyiBiotec)選擇的PBMC免疫中分離CD56+NK細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與凋亡檢測(cè):為了在存在或不存在患者血清或NK細(xì)胞的情況下進(jìn)行凋亡檢測(cè)，我們使用了人類(lèi)原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞HCC，該細(xì)胞系在含有10%胎牛血清(FCS，Sigma)的ATCC配制的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在指定的實(shí)驗(yàn)中，使用樣品血清代替FCS。將NK和HCC細(xì)胞以1∶10的比例在含有指定血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24 h。使用FITC-Annexin和碘化丙啶(Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，Biofriend，CN)進(jìn)行雙重染色，評(píng)估HCC細(xì)胞的凋亡率，并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分類(lèi)。

1.3.3 NK細(xì)胞毒性:用K562靶向紅白血病細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)集，美國(guó))培養(yǎng)，檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。細(xì)胞用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Sigma Aldrich)染色，溫育4 h后收集。加入碘化丙錠(Becton Dickinson，美國(guó))以確定死靶細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 患者人口學(xué)資料與圍手術(shù)期臨床特點(diǎn) 共有232名患者參加了這項(xiàng)研究。在排除幾種情況后，納入196例患者。將患者隨機(jī)分為單純?nèi)榻M(G組，n=98)和全麻下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯組(PG組，n=98)。它們的特性如表1所示。2組患者在年齡、身高、體重、腫瘤分期、手術(shù)方式、ASA狀態(tài)等方面無(wú)明顯差異。但是，在手術(shù)過(guò)程中，PG組瑞芬太尼用量明顯低于G組(P=0.001)。G組與PG組其他生命體征(包括動(dòng)脈壓、心率)無(wú)明顯差異。見(jiàn)表1～3。

表1 患者一般資料 n=98

2.2 全身麻醉下Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量和功能的影響 為了探究2組的不同免疫應(yīng)答，我們首先檢測(cè)了NK細(xì)胞的數(shù)量。G組術(shù)前NK細(xì)胞約占PBMC的(17.2±3.53)%，全麻后降至(13.36±3.07)%(P=0.023)。PG組NK細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異。比較2組術(shù)后NK細(xì)胞數(shù)量時(shí)，PG組顯示PBMC中NK細(xì)胞的占有率明顯高于G組(P=0.036)。對(duì)于G組和PG組，NK細(xì)胞的凋亡率在手術(shù)前后均未受到影響。PG組和G組NK細(xì)胞凋亡率也相近。術(shù)后2組NK細(xì)胞的殺傷活性均顯著降低(P<0.001)。

表2 患者麻醉、手術(shù)時(shí)間及術(shù)中藥物使用情況

表3 患者術(shù)中生命體征

然而，術(shù)后PG組比G組具有更多的功能性NK細(xì)胞(P=0.007)。見(jiàn)表4。

表4 手術(shù)期間使用Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對(duì)NK細(xì)胞的影響

表5 2組患者NKT、T輔助1細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的PBMC百分比

2.4 HCC細(xì)胞的凋亡率 我們研究了受試者的血清是否會(huì)影響HCC細(xì)胞的凋亡率。我們用正?；颊?、G組和PG組患者的血清處理HCC細(xì)胞。在沒(méi)有NK細(xì)胞的情況下，3種處理之間沒(méi)有觀察到HCC凋亡率的差異。在存在NK細(xì)胞的情況下，G組患者(n=20)的血清與正常血清相比，顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。G組和PG組術(shù)后血清培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯低于術(shù)前(G組，P<0.001；PG組，P=0.017)。但與PG組術(shù)后血清相比，G組術(shù)后血清明顯抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡率(P=0.031)，說(shuō)明G組術(shù)后血清對(duì)NK細(xì)胞功能的抑制作用可能強(qiáng)于PG組術(shù)后血清。在受試者血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后HCC細(xì)胞的凋亡率。乳腺癌細(xì)胞在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)或與NK細(xì)胞一起培養(yǎng)。通過(guò)用FITC-Annexin V和碘化丙啶進(jìn)行雙重染色來(lái)確定凋亡，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖1。

表6 2組患者HCC細(xì)胞的凋亡率

圖1 2組HCC細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，與全身麻醉方法相比，Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯在術(shù)中瑞芬太尼消耗量更少。PecsⅡ主要通過(guò)改變?nèi)橄侔┦中g(shù)患者血液中細(xì)胞比例來(lái)影響免疫系統(tǒng)。此外，PecsⅡ還增強(qiáng)了NK細(xì)胞的殺傷活性，表明PecsⅡ也對(duì)免疫細(xì)胞功能有影響。在最近的一項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的觀察結(jié)果[19]，與對(duì)照組相比，術(shù)前使用羅哌卡因進(jìn)行Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯，手術(shù)期間瑞芬太尼的用量顯著減少。

眾所周知，麻醉的選擇至關(guān)重要，因?yàn)樗赡芘c癌癥的復(fù)發(fā)有關(guān)[3]。盡管手術(shù)切除可以去除大部分癌癥組織，但仍有少量癌細(xì)胞保留在體內(nèi)[20]。在這方面，麻醉誘導(dǎo)的免疫抑制和手術(shù)引起的應(yīng)激可以幫助這些癌細(xì)胞的擴(kuò)散和存活。除了對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用外，在實(shí)驗(yàn)和臨床上還發(fā)現(xiàn)手術(shù)與血管生成增加和促進(jìn)轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。還發(fā)現(xiàn)阿片類(lèi)麻醉藥物抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫[21]，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[22]。在大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼可抑制NK細(xì)胞活性和淋巴細(xì)胞增殖[23]。在臨床研究中也觀察到瑞芬太尼對(duì)免疫的類(lèi)似抑制作用[24,25]。因此，減少使用阿片類(lèi)藥物如瑞芬太尼可能有益于癌癥患者的預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后外周血單核細(xì)胞中的NK細(xì)胞百分比及其殺傷活性顯著下降，這與手術(shù)和麻醉誘導(dǎo)的免疫抑制有關(guān)。令人印象深刻的是，使用Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對(duì)NK細(xì)胞數(shù)量和功能的抑制作用較小。我們是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯對(duì)NK細(xì)胞具有支持作用的研究。這對(duì)于Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯在外科手術(shù)中的進(jìn)一步臨床應(yīng)用至關(guān)重要，因?yàn)槊庖哒{(diào)節(jié)可部分決定腫瘤的復(fù)發(fā)。術(shù)中未觀察到NKT和T淋巴細(xì)胞的變化。然而，之前有研究報(bào)道，手術(shù)可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞和NKT細(xì)胞的顯著丟失[24,26,27]。可能是由于手術(shù)方式和癌癥類(lèi)型的不同而導(dǎo)致了有爭(zhēng)議的結(jié)論。一篇文獻(xiàn)研究了丙泊酚對(duì)乳腺癌患者T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)術(shù)后NK細(xì)胞數(shù)量明顯減少[28]。

在NK細(xì)胞存在的情況下，PG組術(shù)后血清培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯高于G組。結(jié)果提示PG組可能含有更多支持NK細(xì)胞增殖或殺傷活性的細(xì)胞因子。

除了血液中的這些免疫細(xì)胞外，研究PecsⅡ阻滯是否對(duì)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞有影響也很重要。例如，腫瘤組織和周?chē)|(zhì)區(qū)的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)或PD-1和PD-L1水平是確定Pecs-Ⅱ阻滯如何影響與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的免疫功能的重要參數(shù)，本研究省略了這些參數(shù)。但是，在我們的進(jìn)一步研究中，有必要研究PecsⅡ阻斷對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)的影響。

綜上所述，術(shù)后Ⅱ型胸神經(jīng)阻滯可增加外周血單核細(xì)胞(PBMC)中NK細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)其殺傷活性，改善乳腺癌患者免疫功能。