TGF-β1對(duì)SKOV-3細(xì)胞EMT的影響及相關(guān)分子機(jī)制研究

閆曉楠 杜輝 左宏玲 張娜 王惠蘭 徐春琳

卵巢癌為女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅全球女性的生命健康。其發(fā)病隱匿，早期階段無(wú)特異癥狀，確診時(shí)通常已是Ⅲ～Ⅳ期，該疾病全球范圍內(nèi)的5年生存率低于30%[1]。影響患者生存率的主要因素包括腫瘤對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)以及遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。因而，卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制仍為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。已有研究表明，惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的時(shí)，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[2,3]。EMT變化主要為E鈣粘蛋白(即E-cadherin)表達(dá)下調(diào)，而N鈣粘蛋白(即N-cadherin)表達(dá)上調(diào)[4,5]。堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Twist)蛋白是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，活化后的Twist可上調(diào)N-cadherin蛋白并下調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展[5]。多種因子在腫瘤微環(huán)境中可促進(jìn)EMT的發(fā)生，其中一個(gè)關(guān)鍵的誘導(dǎo)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)[6]，可顯著地影響女性卵巢疾病的發(fā)展過(guò)程，值得高度關(guān)注[7]。當(dāng)TGF-β1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，涉及多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，位于下游的PI3K/Akt信號(hào)通路(非Smad依賴性的)表現(xiàn)突出[8]。因而，本研究以EMT為切入點(diǎn)，探討SKOV-3細(xì)胞EMT發(fā)生時(shí)受TGF-β1影響的相關(guān)規(guī)律，進(jìn)而對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的作用進(jìn)行分析，以期為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 采用北大人民醫(yī)院提供的SKOV-3細(xì)胞(人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞)，通過(guò)含胎牛血清(10%)的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。其他試劑包括Sigma生產(chǎn)的MTT，Cambridge公司生產(chǎn)的Transwell小室，以及貝博公司生產(chǎn)的蛋白裂解液，Peprotech生產(chǎn)的TGF-β1，SantaCruz生物技術(shù)公司所生產(chǎn)的Twist、N-cadherin和E-cadherin等三類單克隆抗體，p-Akt(Thr308)多克隆抗體等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組在無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)基中接種SKOV-3細(xì)胞(鏈霉素100 U/ml、青霉素100 U/ml、胎牛血清10%)，在溫度為37℃且含有5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。MTT法檢測(cè)各種TGF-β1濃度條件下(1、2、5、10 ng/ml)分別作用24、48 h后SKOV-3細(xì)胞的增殖情況，對(duì)照組為TGF-β1(0 ng/ml)；Transwell檢測(cè)各組連續(xù)培養(yǎng)48 h后SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力，實(shí)驗(yàn)分組：①TGF-β1組(濃度1、2、5、10 ng/ml)、②LY294002組(PI3K抑制劑，濃度10 μmol/ml)、③LY294002+TGF-β1組(10 μmol/ml LY204002干預(yù)30 min后加入10 ng/ml TGF-β1)，④對(duì)照組(PBS)；采用Western blot法對(duì)各組中N-cadherin、E-cadherin、Twist以及p-Akt的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)(藥物作用48 h后進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取)。分組如下：①TGF-β1組(10 ng/ml)，②LY294002組(10 μmol/ml)，③LY294002+TGF-β1組(10 μmol/ml LY294002干預(yù)30 min后加入10 ng/ml TGF-β1)，④對(duì)照組(RPMI-1640)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)各種濃度TGF-β1干預(yù)后SKOV-3細(xì)胞的增殖活性:在96孔板(3×104個(gè)/ml的濃度，而且每個(gè)孔均為200 μl)中接種細(xì)胞，在含有5% CO2、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中放置，待細(xì)胞出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象后根據(jù)分組的情況換液，此時(shí)標(biāo)記為0 h。各組均設(shè)置復(fù)孔5個(gè)。24、48 h后，培養(yǎng)終止前將MTT(10 μl)添加到所有的孔中，進(jìn)行4 h的孵育。進(jìn)行吸光度(OD值)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力:1∶3進(jìn)行Matrigel基質(zhì)膠的稀釋，在Transwell小室中的聚碳酸酯膜之上將其鋪展開，進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)?zāi)M。將共計(jì)200 μl的細(xì)胞懸液(每個(gè)孔為3×104個(gè))添加到上室，完全培養(yǎng)基添加到下室，各組中平行小室數(shù)量均為3個(gè)。等體積PBS作為趨化劑作用于SKOV-3細(xì)胞為對(duì)照組。置于培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，PBS洗膜，棉拭子擦凈上室內(nèi)細(xì)胞及Matrigel基質(zhì)膠，多聚甲醇固定10 min，蘇木素染色后自來(lái)水沖洗，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿透Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)目。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-Akt、Twist、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達(dá)情況:不同干預(yù)方式作用48 h后提取各組細(xì)胞蛋白，Nanodrop進(jìn)行蛋白定量。通過(guò)SDS-PAGE凝膠對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，室溫下脫脂奶粉(5%)封閉1 h，再添加一抗(按0.1/cm2膜的比例)。4℃過(guò)夜，采用Tris-HCI緩沖鹽溶液進(jìn)行共計(jì)3次洗膜操作，時(shí)長(zhǎng)均為10 min，然后將山羊抗兔IgG(1∶2 000)二抗和山羊抗鼠IgG(1∶2 000)加入(均已通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記)，室溫孵育2 h，洗膜3次，具體操作流程同前，再通過(guò)ECL法進(jìn)行顯影。ImageJ分析蛋白灰度值，獲得各實(shí)驗(yàn)組中4種蛋白表達(dá)水平。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以獲得可靠數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGF-β1作用不同時(shí)間后SKOV-3細(xì)胞的增殖活性比較 MTT結(jié)果顯示：不同濃度TGF-β1(0、1、2、5、10 ng/ml)刺激SKOV-3細(xì)胞24、48 h后，隨著TGF-β1濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)OD值有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即TGF-β1對(duì)SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用不明顯。見表1。

表1 各濃度TGF-β1作用不同時(shí)間后SKOV-3細(xì)胞OD值結(jié)果

2.2 T組細(xì)胞的侵襲能力比較 根據(jù)Transwell相關(guān)結(jié)果可知：進(jìn)行各濃度TGF-β1干預(yù)后，穿過(guò)小室的SKOV-3細(xì)胞數(shù)目均多于對(duì)照組，并且隨著TGF-β1的濃度增高，穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)目逐漸增多(P<0.05)；單獨(dú)應(yīng)用LY294002及聯(lián)合TGF-β1處理后，穿過(guò)小室細(xì)胞SKOV-3數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見表2。

表2 Transwell小室檢測(cè)不同處理后SKOV-3穿膜細(xì)胞數(shù)

2.3 各組SKOV-3細(xì)胞p-Akt、Twist、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，SKOV-3細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用后：p-Akt、 Twist和N-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；LY294002單獨(dú)作用或與TGF-β1聯(lián)合處理后p-Akt、Twist和N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低；E-cadherin蛋白的表達(dá)與此相反(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 不同干預(yù)方式作用48h后SKOV-3細(xì)胞中p-Akt、Twist和N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)情況

表3 SKOV-3細(xì)胞中各蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值

3 討論

研究表明，對(duì)于不同類型的上皮來(lái)源惡性腫瘤而言，在其侵襲以及轉(zhuǎn)移等的相關(guān)過(guò)程中，EMT具有十分關(guān)鍵的影響，被認(rèn)為是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的先決條件之一[9]。腫瘤上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后，獲得運(yùn)動(dòng)遷移能力，脫離原發(fā)病灶，浸潤(rùn)周圍組織并進(jìn)入血液循環(huán)轉(zhuǎn)移、種植到較遠(yuǎn)部位。而對(duì)于上皮間葉而言，EMT的重要條件之一就是TGF-β1的誘導(dǎo)[10]，此過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，尤其值得注意的就是PI3K/Akt信號(hào)通路(它是非Smad依賴性的)。因此，本研究觀察TGF-β1對(duì)人上皮性卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株EMT發(fā)生的影響，并探討PI3K/Akt信號(hào)通路在其中的作用，以期為臨床提供潛在的治療靶點(diǎn)。

3.1 TGF-β1對(duì)SKOV-3細(xì)胞EMT的影響 TGF-β1具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，可促進(jìn)腫瘤的增殖、分化、促進(jìn)腫瘤血管生成，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于TGF-β1在卵巢癌的研究多在血清學(xué)或蛋白水平，結(jié)果顯示TGF-β1在卵巢癌患者中表達(dá)水平增加；也有學(xué)者認(rèn)為TGF-β1在卵巢癌中主要在基因水平發(fā)揮調(diào)控作用[12,13]。然而，人卵巢癌上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT的過(guò)程和侵襲轉(zhuǎn)移等是否受到TGF-β1的誘導(dǎo)及其機(jī)制尚未明確。

Vergara等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MTT法結(jié)果顯示，TGF-β1對(duì)卵巢癌上皮細(xì)胞增殖作用無(wú)明顯影響。本研究中，MTT法檢測(cè)不同濃度TGF-β1分別作用于SKOV-3細(xì)胞24、48 h，結(jié)果顯示：TGF-β1對(duì)SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用不明顯。為進(jìn)一步觀察TGF-β1對(duì)SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響，本研究采用不同濃度TGF-β1持續(xù)刺激SKOV-3細(xì)胞48 h，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：TGF-β1處理后SKOV-3細(xì)胞穿過(guò)小室數(shù)目多于對(duì)照組，且隨濃度的增加而增加(P<0.05)，即TGF-β1可促使SKOV-3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力增強(qiáng)。據(jù)MTT和Transwell結(jié)果推測(cè)，TGF-β1刺激SKOV-3細(xì)胞后侵襲能力增強(qiáng)，可能是由于形態(tài)學(xué)上的變化引起，而非細(xì)胞增殖數(shù)目增多所致。

EMT是上皮細(xì)胞原有極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得，主要表現(xiàn)為E-cadherin出現(xiàn)了一定程度的表達(dá)下調(diào)；而N-cadherin則出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)，上述過(guò)程可由Twist等進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)控[4,5]。Wu等[15]體外細(xì)胞研究證實(shí)，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ECC-1中Twist、N-cadherin高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)，三者共同作用在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞EMT的發(fā)生中起重要作用；Twist/N-cadherin siRNA的應(yīng)用可降低其表達(dá)水平從而使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。上述結(jié)果提示，Twist/N-cadherin信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

本研究采用TGF-β1(10 ng/ml)刺激SKOV-3細(xì)胞48 h后提取蛋白，Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)TGF-β1處理后轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白表達(dá)上調(diào)，N-cadherin蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。上述結(jié)果顯示TGF-β1作用于SKOV-3細(xì)胞后抑制其E-cadherin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)N-cadherin蛋白的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,5,15]，即TGF-β1可誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞發(fā)生EMT，獲得間質(zhì)特性，為腫瘤細(xì)胞通過(guò)基底膜發(fā)生浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供機(jī)會(huì)。TGF-β1誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞EMT的發(fā)生，可能是通過(guò)刺激Twist的表達(dá)上調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

3.2 TGF-β1誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞發(fā)生EMT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 磷脂酰肌醇3激酶(phosphaatidylinositlo 3kinase，PI3K)是生物體重要的胞內(nèi)激酶，具有磷脂酰肌醇激酶及絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路被激活后，可提高細(xì)胞存活能力，凋亡過(guò)程受到抑制，對(duì)腫瘤的EMT起促進(jìn)作用[16,17]。因此，探索EMT靶點(diǎn)相關(guān)抑制劑有著重要的臨床應(yīng)用前景。Chen等[18]的結(jié)果表明，骨形態(tài)蛋白2(bone morphogenetic proteins，BMP-2)可上調(diào)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞中的p-Akt蛋白的表達(dá)，從而有利于EMT的發(fā)生；采用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)對(duì)SKOV-3細(xì)胞EMT過(guò)程起到顯著抑制作用，侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。上述結(jié)果表明，BMP-2可能是通過(guò)PI3K/Akt通路來(lái)誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞EMT的發(fā)生。另外的研究顯示，在胃癌和結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，即PI3K/Akt信號(hào)通路可介導(dǎo)上皮性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，并且此作用可被PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑所逆轉(zhuǎn)[19-22]。

本研究第一部分已證實(shí)TGF-β1可誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞發(fā)生EMT，但是否經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，目前尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此做了進(jìn)一步研究，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：無(wú)論單獨(dú)應(yīng)用LY294002還是先用LY294002預(yù)處理30 min后再給予TGF-β1刺激，SKOV-3細(xì)胞的侵襲能力均顯著降低(P<0.05)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[14-16]相似。本研究中Westernblot分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，SKOV-3細(xì)胞受TGF-β1刺激后，除了E-cadherin表達(dá)水平降低，無(wú)論是N-cadherin、轉(zhuǎn)錄因子Twist還是p-Akt等蛋白均出現(xiàn)了表達(dá)增加的現(xiàn)象。PI3K/Akt通路抑制劑LY294002作用于SKOV-3細(xì)胞后上述各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)相反趨勢(shì) (P<0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[18-20,23]。上述結(jié)果提示：TGF-β1作用于SKOV-3細(xì)胞后，PI3K/Akt通路被激活，p-Akt表達(dá)水平上調(diào)，接著上調(diào)Twist表達(dá)水平，進(jìn)而N-cadherin表達(dá)水平的上調(diào)，E-cadherin表達(dá)水平的下調(diào)，從而使SKOV-3受到誘導(dǎo)，EMT發(fā)生，最終SKOV-3細(xì)胞侵襲以及轉(zhuǎn)移能力增加。應(yīng)用LY294002后，有效地抑制了SKOV3-細(xì)胞p-Akt自身的活性，下調(diào)了Twist的表達(dá)水平，對(duì)EMT發(fā)生起到逆轉(zhuǎn)作用，最終使腫瘤細(xì)胞具有的侵襲轉(zhuǎn)移能力被顯著降低。

綜上所述，TGF-β1/PI3K/Akt信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，應(yīng)用相應(yīng)抑制劑可降低此通路中多個(gè)下游分子的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[24-27]。分子靶向治療技術(shù)是未來(lái)卵巢癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，特別是在持續(xù)地探討TGF-β1/PI3K/Akt的相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)科學(xué)問(wèn)題之后，有望發(fā)現(xiàn)新型治療靶點(diǎn)，從而促進(jìn)卵巢癌基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。