抑制腦信號(hào)蛋白3A對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響及作用機(jī)制研究

帥歡 唐繼軍 凌利平

糖尿病腎病是糖尿病中常見(jiàn)的一種微血管并發(fā)癥，且常伴隨炎癥狀態(tài)。嚴(yán)重時(shí)可直接導(dǎo)致腎功能不全，是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的重要因素之一[1]。因此早期的預(yù)防和治療是減少和避免糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵。有研究表明，腦信號(hào)蛋白3A的表達(dá)能夠作為診斷糖尿病腎病的發(fā)生及蛋白尿嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[2]。腦信號(hào)蛋白3A是能夠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向軸突生長(zhǎng)方向，隨著更多的研究證明，其還能夠參與細(xì)胞的遷移、腫瘤生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[3]。但目前筆者所見(jiàn)臨床上對(duì)腦信號(hào)蛋白3A于糖尿病腎病影響機(jī)制研究較少，因此在本文研究中為尋找治療糖尿病腎病的方向，建立糖尿病腎病模型大鼠，通過(guò)抑制腦信號(hào)蛋白3A的表達(dá)，觀察下調(diào)腦信號(hào)蛋白3A對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動(dòng)物：選取SPF級(jí)40只SD健康大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK20060009)，由基爾頓生物科技(上海)有限公司提供，鼠齡(3.5±0.2)個(gè)月，體重(219.7±8.5)g。大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1周。本實(shí)驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：大鼠抗小鼠TGF-β1抗體(上海一基實(shí)業(yè)有限公司)；小鼠抗大鼠α-SMA抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)；兔抗大鼠骨形成蛋的(BMP7)抗體、E-Cadherin抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)；兔抗小鼠Smad6抗體(上海恒斐生物科技有限公司)；24 h尿微蛋白 ELISA試劑盒(南京卡米洛生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥:隨機(jī)選取40只大鼠中10只作為正常組，剩余大鼠參照陳衛(wèi)東等[4]研究實(shí)驗(yàn)中糖尿病腎病模型大鼠建立方法建立模型，30只大鼠均通過(guò)高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，進(jìn)行腹腔注射，一次性注射55 mg/kg的鏈脲佐菌素，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射枸椽酸鹽緩沖液，72 h后使用血糖儀測(cè)定血糖，血糖≥16.7 mmol/L，則表示糖尿病模型建造成功，24 h尿量大于造模前50%且24 h尿蛋白排泄率>30 mg/24 h，表示糖尿病腎病模型制備成功。將建模成功的30只糖尿病腎病模型大鼠隨機(jī)分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組，每組10只。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取大鼠過(guò)上調(diào)組、下調(diào)組大鼠腎臟組織細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行融合，融合率在75%時(shí)，行胰酶消化，之后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)消化后的細(xì)胞密度進(jìn)行測(cè)量，然后將細(xì)胞植于六孔板中，大約種植4×105個(gè)細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，并在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)融合率在40%～80%時(shí)，取1.5 μl DNA溶于100 μl雙抗培養(yǎng)基中，進(jìn)行混合，混合后進(jìn)行離心處理，并在EP管中加入12 μl的PolyFect Reagent，上下顛倒5次，混勻處理，之后進(jìn)行靜置5～10 min，對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物起到促進(jìn)作用，并吸去六孔板加入，在含有轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μl完全培養(yǎng)基，顛倒2次，進(jìn)行搖晃，促進(jìn)復(fù)合物的均勻分布，然后之后進(jìn)行培養(yǎng)24 h后換液處理，倒置，使用熒光顯微鏡下對(duì)熒光亮度進(jìn)行觀察，然后進(jìn)行收集，提取RNA，將轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養(yǎng)皿中，使用40 μl 嘌呤霉素至每孔常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后棄去培養(yǎng)液,選取PCR驗(yàn)證篩選的細(xì)胞消化處理并稀釋?zhuān)♂尯笾糜?4孔板中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腦信號(hào)蛋白3A上調(diào)組(上調(diào)組)、腦信號(hào)蛋白3A下調(diào)組(下調(diào)組)。

1.2.3 切片及染色：取大鼠腎臟組織，在4%多聚甲醛進(jìn)行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，之后脫水、透明，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.2.4 BUN、Scr、UA、血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白、血脂水平檢測(cè)：采用Olympus AU640全自動(dòng)生化測(cè)定儀對(duì)尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿酸(UA)、血糖、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平進(jìn)行檢測(cè)；采用TOSOH公司生產(chǎn)的G7糖化血紅蛋白分析儀對(duì)糖化血紅蛋白進(jìn)行檢測(cè)；采用放射免疫法對(duì)24 h尿微蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 GSH-Px、GSH、CAT水平檢測(cè):采用DNTB比色法對(duì)超氧化物歧化酶(GSH-Px)活性進(jìn)行檢測(cè)；采用Beutler改良法對(duì)谷胱甘肽(GSH)含量進(jìn)行檢測(cè)；采用容量法對(duì)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 腎小球結(jié)構(gòu)指標(biāo)檢測(cè):采用ImageJ1.40圖像分析軟件對(duì)腎小球基底膜厚度、足突寬度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.7 TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白檢測(cè)：使用蛋白免疫印跡(Western blot)對(duì)TGF-β1/Smad6/BMP7中TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin通路蛋白進(jìn)行檢測(cè)，提取大鼠肺組織中的樣品總蛋白，將其與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，進(jìn)行電泳，并將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin按照1∶1 000稀釋)，在4℃條件下進(jìn)行震蕩過(guò)夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin按照1∶5 000稀釋)，室內(nèi)震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常；模型組腎小球肥大，重度系膜細(xì)胞增生，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；上調(diào)組腎小球嚴(yán)重肥大，伴隨重度增生和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；下調(diào)組大鼠少量膠原纖維化，間質(zhì)輕度纖維化，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

正常組 模型組 上調(diào)組 下調(diào)組

2.2 4組大鼠BUN、Scr、UA水平比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠BUN、Scr、UA水平比較

2.3 4組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組、大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白比較

2.4 4組大鼠血脂水平比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組、大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠血脂水平比較

2.5 4組大鼠氧化抗氧化酶水平比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠GSH-Px、GSH、CAT水平高于上調(diào)組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組大鼠氧化抗氧化酶水平比較

2.6 4組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度高于模型組(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度低于模型組(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎小球基底膜厚度、足突寬度低于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 4組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

2.7 4組大鼠腎組織TGF-β1/Smad6/BMP7信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)量高于正常組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達(dá)量低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)量高于模型組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達(dá)量低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)量低于模型組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)量低于上調(diào)組，且Smad6、BMP7、E-Cadherin蛋白表達(dá)量高于上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖2。

表6 4組大鼠腎組織TGF-β1/Smad6/BMP7信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

圖2 腎組織中TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白Western blot圖

3 討論

糖尿病腎病是指糖尿病微血管病變最終導(dǎo)致腎小球硬化一種疾病，又稱(chēng)為糖尿病腎小球綜合征。高血糖是引起腎臟微血管病變的主要原因之一，而高血壓和高血脂是導(dǎo)致疾病加重的重要因素[5,6]。張馨元等[7]研究表明，足細(xì)胞的表觀遺傳修飾、氧化應(yīng)激、糖代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)改變、炎性細(xì)胞因子、胰島素抵抗等損傷機(jī)制及相關(guān)蛋白的影響作用，對(duì)糖尿病腎病的調(diào)控機(jī)制及疾病進(jìn)展具有重要意義。

腦信號(hào)蛋白3A是由多個(gè)不同功能的亞群組成，其所有成員均有一個(gè)高度保守的氨基酸序列，由500多個(gè)氨基酸組成，被稱(chēng)為Sema結(jié)構(gòu)域[8]。其結(jié)構(gòu)域是腦信號(hào)蛋白發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)。有研究表明，腦信號(hào)蛋白3A是抑制神經(jīng)軸突延伸發(fā)展的重要結(jié)構(gòu)，且包含這多種氨基酸序列[9]。糖尿病是糖尿病腎病重要的并發(fā)癥之一，目前，其發(fā)病率僅次于腎小球炎，呈逐年上升趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)組大鼠BUN、Scr、UA水平低于上調(diào)組，此結(jié)果說(shuō)明，抑制腦信號(hào)蛋白3A的表達(dá)，能夠降低對(duì)腎組織中BUN、Scr、UA水平，且減少對(duì)腎組織的損傷。有研究表明，腦信號(hào)蛋白3A在足突細(xì)胞及集合管內(nèi)皮細(xì)胞中均呈現(xiàn)出高表達(dá)[10]。腦信號(hào)蛋白3A的過(guò)度表達(dá)可直接導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并對(duì)腎小球基膜也會(huì)造成一定的損害。腦信號(hào)蛋白3A在正常機(jī)體內(nèi)并不表達(dá)，在尿鏈佐菌素至糖尿病腎病大鼠模型中，隨著時(shí)間的增加其表達(dá)顯著升高。孫藝欣[11]等研究表明，Sema 3A與早期腎損傷的發(fā)生密切相關(guān)，可作為CIAKI的早期生物標(biāo)志物。因此在本文中通過(guò)抑制腦信號(hào)蛋白3A表達(dá)，觀察對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響，結(jié)果顯示，抑制腦信號(hào)蛋白3A能夠降低對(duì)腎組織的損傷，效果顯著。

糖尿病的發(fā)生會(huì)對(duì)腎臟產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，時(shí)腎小球體積增大，系膜細(xì)胞發(fā)生增生、肥大等情況，部分腎小管組織出現(xiàn)空泡變性，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡情況。糖尿病腎病的發(fā)生會(huì)對(duì)血糖、血脂水平造成嚴(yán)重的影響。有研究表明，血糖波動(dòng)幅度過(guò)大會(huì)加劇DN患者機(jī)體炎癥狀態(tài)，損害患者肝腎功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白、血脂水平均低于上調(diào)組，此結(jié)果說(shuō)明，抑制腦信號(hào)蛋白3A，能夠降低血糖、糖化血紅蛋白、24 h尿微蛋白、血脂表達(dá)水平，降低腎組織損傷程度。與張莉等[13]研究結(jié)果一致。糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，其關(guān)系到腎小球的過(guò)濾狀態(tài)、足細(xì)胞凋亡、腎小管損傷等。在本文研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)組大鼠氧化抗氧化酶水平高于上調(diào)組，且腎小球基底膜厚度、足突寬度低于上調(diào)組，由此可得，抑制腦信號(hào)蛋白3A能夠提高氧化抗氧化酶水平，且減少對(duì)腎小管結(jié)構(gòu)指標(biāo)的損傷。廖正[14]的研究表明，Sema3A過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)腎足細(xì)胞足突消失或發(fā)育延遲，抑制輸尿管芽分支和腎小球血管正常形成，導(dǎo)致腎小球發(fā)育不良和蛋白尿。與本文研究結(jié)果保持一致。

腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)化，在一定條件下其過(guò)程是可逆的。TGF-β1/Smad6/BMP7信號(hào)通路能夠參與細(xì)胞間質(zhì)化的過(guò)程，TGF-β1具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，參與炎癥的發(fā)生，能夠在多個(gè)方面加快糖尿病腎病的病程進(jìn)展[15]。Smads蛋白家族是TGF-β1受體激酶的底物，也是其通路中重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子[16]。BMP7能夠通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞膠原和α-SMA的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞間質(zhì)。Smad6和BMP7在糖尿病腎病腎纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮著重要做用，是保護(hù)腎臟組織的重要因子[17]。α-SMA是一種肌纖細(xì)胞蛋白，其主要寄存與正常腎血管的平滑及細(xì)胞中，若其他其細(xì)胞中表達(dá)，則說(shuō)明上皮間質(zhì)發(fā)生病變[18,19]。e-cadherin是屬于跨膜蛋白，也是鈣粘附蛋白E，是一種鈣依賴(lài)性的跨膜蛋白，且能夠參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附，其主要分布于人和動(dòng)物的上皮細(xì)胞，能夠維持細(xì)胞的極性和完整性[20]。因此本研究中對(duì)TGF-β1/Smad6/BMP7通路蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，下調(diào)組大鼠腎組織中TGF-β1、BMP7、α-SMA蛋白表達(dá)量低于上調(diào)組，且Smad6、E-Cadherin蛋白表達(dá)量高于下調(diào)組，此結(jié)果說(shuō)明，抑制腦信號(hào)蛋白3A可有效改善大鼠腎組織TGF-β1、BMP7、α-SMA、Smad6、E-Cadherin蛋白表達(dá)量，減少腎損傷。

綜上所述，抑制腦信號(hào)蛋白3A能夠減少腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足突細(xì)胞的損傷，降低對(duì)腎小球基膜的損害，其作用機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad6/BMP7信號(hào)通路有關(guān)。