藍莓酵素加工工藝及其優(yōu)化研究

吳林生 徐德聰

摘要 以藍莓為原料，研究不同因素對藍莓酵素發(fā)酵的影響，以確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)。研究紅糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間以及添加酵母菌種類4個因素對藍莓酵素發(fā)酵液的影響，并記錄發(fā)酵液pH的變化，對發(fā)酵產品的色澤、氣味及滋味進行感官評價，并以超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除能力為理化檢測指標進行分析，最終確定藍莓酵素發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。藍莓酵素發(fā)酵加工的最優(yōu)工藝參數(shù)如下：藍莓酵素發(fā)酵液的pH為4.5，藍莓與紅糖質量比為1∶1，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時間為28 d，添加葡萄酒酵母時超氧化物歧化酶活性最高，DPPH自由基清除能力最強，感官評分最高。

關鍵詞 藍莓;酵素;超氧化物歧化酶;DPPH自由基

中圖分類號 TS255.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）07-0184-04

Abstract Taking blueberry as raw materials，the effects of different factors on the fermentation of blueberry enzymes were studied，the optimal fermentation process parameters were determined.The effects of four factors，namely the amount of brown sugar added，the fermentation temperature，the fermentation time and the addition of yeast strains，on the fermentation broth of? blueberry enzymes were studied，the pH changes of the fermentation broth were recorded.The sensory evaluation was made on the color，odor and taste of the fermentation products.The superoxide dismutase （SOD） activity and scavenging capacity of DPPH free radicals were used as physical and chemical indices for analysis.Finally，the optimum technology parameters for the fermentation of blueberry enzymes were determined.The research results showed that the optimum processing technology parameters for the fermentation of blueberry enzymes were as follows：pH of the blueberry enzyme fermentation broth was 45，the mass ratio of blueberry and brown sugar was 1∶1，the fermentation temperature was 25 ℃，the fermentation time was 28 days， wine yeast was added.Under the above processing technology parameters，SOD activity was the highest，DPPH free radical scavenging capacity was the strongest，the sensory score was the? best.

Key words Blueberry;Enzyme;Superoxide dismutase;DPPH free radicals

作者簡介 吳林生（1984—），女，安徽合肥人，實驗員，從事農產品加工與貯藏研究。

藍莓為越橘屬植物，原產地為美國佛羅里達州，也稱為藍漿果，成熟后的果實接近圓形或者扁圓形，呈現(xiàn)藍紫色，外皮有一層白色果粉[1]。藍莓鮮果皮薄多汁、水分含量非常高，有“漿果之王”之稱，富含維生素、果酸和礦物質等營養(yǎng)物質，還富含花青素以及原花青素等多酚類化合物與多糖類化合物，具有抗氧化、抗癌和抗炎作用，對慢性疾?。ㄈ缣悄虿?、肥胖癥以及骨質疏松等）有益[2-3]，所以被國際糧農組織稱為人類五大健康食品之一[4]。因此，近些年越來越多的人開始關注藍莓以及與藍莓相關的產品，也有越來越多的人開始種植藍莓。

酵素是一種近年來在日本以及中國臺灣地區(qū)非常流行的功能性食品。酵素主要是果蔬和可食用的藥材經(jīng)過可食用菌種在一定的條件下發(fā)酵而成的對人體有益的食用品[5]，這些食用品經(jīng)過益生菌發(fā)酵形成的各種代謝產物能夠有效調理以及促進人體腸胃的消化吸收、增強人體的免疫力[6]。人體適當攝取酵素可以延緩機體的衰老，也可以延長人們的壽命[7]。酵素（enzyme）是指酵素菌在活動中產生的各種活性物質和酶，也統(tǒng)稱為酶。因其由天然酵素菌產生，無任何副作用等優(yōu)點，酵素深受人民群眾尤其是女性群體的喜愛[8-9]。

日本在20世紀80年代就已經(jīng)掌握熟練相關的生產技術來制備酵素產品，島本覺也家族研制復合了24種有益菌，用于生產酵素及其各種衍生產品，其他國家（包括中國在內）都沒有研究出超過10種的復合菌種[10]。國外酵素的應用相對中國而言更加廣泛，發(fā)展水平也更高，在醫(yī)療、保健等領域更具代表性。從食品、保健角度來看，以蘆薈為例，國外研制出各式各樣的蘆薈發(fā)酵飲品以及保健產品，而國內對蘆薈的使用主要集中在蘆薈本身的狀態(tài)上。從醫(yī)療保健角度來看，在國外酵素已被用于病毒類疾病、關節(jié)炎、癌癥、三高癥等疾病的治療，而國內對蘆薈產品的研究尚處于初步研究階段。隨著酵素越來越被人們關注，國內外各大酵素公司的競爭也越來越激烈[11-12]。

作為近些年食品行業(yè)發(fā)展及關注的焦點，轉基因食品安全問題存在很大爭議，酵素的出現(xiàn)極大地促進了食品及相關行業(yè)的發(fā)展，酵素食品及其相關產品很可能成為保健食品行業(yè)讓人追捧的對象之一[13]。

近些年，藍莓及其加工出來的各種衍生產品越來越受到人們的歡迎，如藍莓酒、藍莓醋、藍莓酸奶等。藍莓食用酵素作為一種新型的功能產品，能夠對人體的健康產生積極、有益的影響。筆者充分利用藍莓和酵素的高營養(yǎng)價值，研究藍莓食用酵素的加工工藝并對其進行優(yōu)化，探討制備高營養(yǎng)價值的藍莓酵素產品的加工及優(yōu)化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料。

藍莓、紅糖、面包酵母（食品級）。

1.1.2 試劑。無水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、鄰苯三酚，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程[14-15]。工藝流程如圖1所示。

1.2.2 藍莓酵素最優(yōu)發(fā)酵工藝條件試驗設計。

藍莓常溫解凍，紅糖紫外滅菌45 min，藍莓按比例與紅糖混合密封裝罐，并用標簽標記。以超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除能力為檢測指標，在其他條件不變的情況下，分別考察藍莓與紅糖質量比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、酵母菌種類對藍莓發(fā)酵液試驗結果的影響。具體水平的設置根據(jù)試驗結果可做適當變動。藍莓與紅糖質量比分別設置為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間35 d，不添加酵母菌進行發(fā)酵。

1.2.2.1 發(fā)酵溫度對藍莓發(fā)酵液的影響：發(fā)酵溫度分別設置21、23、25、27、29 ℃，藍莓與紅糖質量比為1∶1，發(fā)酵時間35 d，不添加酵母菌進行發(fā)酵。

1.2.2.2

發(fā)酵時間對藍莓發(fā)酵液的影響。發(fā)酵時間分別設置7、14、21、28、35、42 d，藍莓與紅糖質量比為1∶1、發(fā)酵溫度25 ℃，不添加酵母菌進行發(fā)酵。

1.2.2.3 酵母菌種類對藍莓發(fā)酵液的影響。分別不用酵母和用葡萄酒酵母（1 g）、面包酵母（1 g）發(fā)酵，藍莓與紅糖質量比為1∶1，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間35 d進行發(fā)酵[16]。

1.2.3 藍莓酵素發(fā)酵液pH測定。每隔7 d取一定量的發(fā)酵液置于燒杯中，用精密pH計測定發(fā)酵液的pH，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 發(fā)酵液DPPH自由基清除能力的測定。每隔7 d取1 mL發(fā)酵液，稀釋30倍，過濾，取濾液待用。

用移液管量取0.02 mg/mL的DPPH-乙醇溶液8? mL置于試管中，加入8? mL樣品，搖晃混勻，在25 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，測定溶液在517 nm波長處的吸光度?？瞻捉M用無

水乙醇代替測定溶液，測定吸光度。按照以下公式計算DPPH自由基清除率（%）：

DPPH自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中，A1為樣品溶液的吸光度，A2為用無水乙醇代替DPPH時測得對應濃度的本底吸光度，A0為空白組的吸光度。

1.2.5 發(fā)酵液超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定。

1.2.5.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定。

用移液管量取0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 mL 緩沖液置于試管中，加入去離子水4.2 mL，置于25 ℃水浴鍋中預熱20 min，加入0.3 mL經(jīng)25 ℃預熱的鄰苯三酚，快速搖晃混勻，開始計時，空白管為10 mmol/L HCl溶液，在420 nm波長下自反應30 s，以30 s為一次間隔，測定吸光度，總測定時長為4 min。

1.2.5.2 樣品酶活性的測定。每隔7 d取1? mL發(fā)酵液，稀釋30倍后過濾，取濾液待用。

用移液管量取0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 mL 緩沖液置于試管中，加入去離子水3.9 mL 、發(fā)酵液0.3 mL，置于25 ℃水浴鍋中預熱20 min，加入0.3 mL經(jīng)25 ℃預熱的鄰苯三酚，快速搖晃，開始計時，空白管為10 mmol/L HCl溶液，在420 nm波長下自反應30? s，以30 s為1次間隔，測定吸光度，總測定時長為4 min。按照以下公式計算酶活性：

酶活性（U）=[（A-B）/A]/50%×反應總體積×（樣品稀釋倍數(shù)/樣液體積）

式中，A為鄰苯三酚自氧化速率，B為發(fā)酵液抑制鄰苯三酚自氧化速率[17-20]。

1.2.6 藍莓酵素發(fā)酵液的感官評價。

將試驗所得的藍莓酵素發(fā)酵液進行色澤、氣味及滋味感官評價，并記錄評分。感官評價由10位身體健康的實驗室小組成員根據(jù)表1進行評分，每項取10人評分的平均值，最后綜合取色澤、氣味和滋味的平均值，平均分取整數(shù)。

2 結果與分析

2.1 藍莓酵素發(fā)酵液pH的變化

每隔7 d取一定量的藍莓與紅糖（質量比為1∶1），發(fā)酵溫度25 ℃，不添加酵母菌發(fā)酵的藍莓酵素發(fā)酵液置于燒杯中，用校準過的精密pH計測定發(fā)酵液的pH，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，藍莓酵素發(fā)酵液的pH在開始14 d變化較大，pH由6.3變?yōu)?.4，此后趨于緩和，pH基本在4.5上下浮動，可見藍莓酵素在發(fā)酵初期發(fā)酵速度較快，14 d后發(fā)酵速度趨于緩慢。pH的下降可能是由于有機酸濃度在發(fā)酵過程中有所增加，pH的升高可能是由于蛋白質被微生物水解以及氨基酸被利用所致。

2.2 不同因素對藍莓酵素發(fā)酵液的影響

2.2.1 藍莓與紅糖質量比對發(fā)酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影響。將藍莓與紅糖的質量比分別設置為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間35 d，不添加酵母菌進行發(fā)酵，結果見圖3。

從圖3可以看出，當藍莓與紅糖質量比為1∶1時，藍莓酵素發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高（95.52%），抗氧化性能最好，加入的紅糖量過高時會影響發(fā)酵液DPPH自由基清除率。

從圖4可以看出，當藍莓與紅糖質量比為1∶1時，藍莓酵素發(fā)酵液的超氧化物歧化酶活性最高，達到68.71 U/mL，此后隨著紅糖量的增加，超氧化物歧化酶活性有所降低。因此，藍莓酵素發(fā)酵液的藍莓與紅糖的最佳質量比為1∶1。

2.2.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影響。

將發(fā)酵溫度分別設置為21、23、25、27、29 ℃，藍莓與紅糖質量比為1∶1，發(fā)酵時間35 d，不添加酵母菌進行發(fā)酵，結果見圖5。

從圖5可以看出，藍莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期時隨發(fā)酵溫度的增加，DPPH自由基清除率逐漸升高，當發(fā)酵溫度為25 ℃時，DPPH自由基清除率達到最高值（95.52%），此后發(fā)酵溫度的增加抑制了藍莓酵素的發(fā)酵，DPPH自由基清除率逐漸下降。

從圖6可以看出，藍莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期時隨發(fā)酵溫度的增加，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出上升趨勢，當發(fā)酵溫度為25 ℃時，超氧化物歧化酶活性達到最高值（68.71 U/mL），此后發(fā)酵溫度的增加抑制了藍莓酵素的發(fā)酵，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出下降趨勢。因此，藍莓酵素發(fā)酵液的最適發(fā)酵溫度為25 ℃。

2.2.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影響。

發(fā)酵時間分別設置7、14、21、28、35、42 d，藍莓與紅糖質量比為1∶1、發(fā)酵溫度25 ℃，不添加酵母菌進行發(fā)酵試驗，結果如圖7所示。

從圖7可以看出，藍莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期隨發(fā)酵時間的增加，DPPH自由基清除率逐漸升高;當發(fā)酵時間達到28 d時DPPH自由基清除率達到最高值（96.79%）;此后，隨發(fā)酵時間的增加，DPPH自由基清除率逐漸下降。

從圖8可以看出，藍莓酵素發(fā)酵液發(fā)酵初期時隨發(fā)酵時間的增加，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出上升趨勢，當發(fā)酵時間為28 d時，超氧化物歧化酶活性達到最高值（69.23 U/mL），此后隨發(fā)酵時間的增加，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出下降趨勢。

因此，藍莓酵素發(fā)酵液的最適發(fā)酵時間為28 d。

2.2.4 不同酵母菌對發(fā)酵液的影響。

分別不用酵母、用葡萄酒酵母（1 g）和面包酵母（1 g）進行發(fā)酵，藍莓與紅糖質量比為1∶1，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間35 d，結果見表2。

從表2可以看出，添加葡萄酒酵母處理發(fā)酵液DPPH自由基清除率最高，添加面包酵母處理次之，不用酵母處理最低;添加葡萄酒酵母處理超氧化物歧化酶活性處理最低，添加面包酵母次之，不用酵母最高。

由此可見，當添加酵母發(fā)酵時藍莓酵素發(fā)酵液的DPPH自由基清除率比不添加酵母發(fā)酵時高，當添加葡萄酒酵母發(fā)酵時DPPH自由基清除率最高，達到97.26%。

當添加酵母發(fā)酵時，藍莓酵素發(fā)酵液的超氧化物歧化酶活性比不添加酵母發(fā)酵時高，其中當添加葡萄酒酵母發(fā)酵時超氧化物歧化酶活性最高，達到70.22 U/mL。因此，藍莓酵素發(fā)酵液可以添加葡萄酒酵母進行發(fā)酵。

2.3 藍莓酵素發(fā)酵液的感官評價 將試驗所得的藍莓酵素發(fā)酵液進行色澤、氣味及滋味感官評價，并記錄評分。10位小組成員分別對藍莓酵素發(fā)酵液進行感官評分，平均分數(shù)取整數(shù)，結果如表3所示。

從表3可以看出，從藍莓與紅糖質量比來看，當藍莓與紅糖質量比為1∶1時平均得分最高（9分），當藍莓與紅糖質量比為3∶1時平均得分最低（5分）;從添加酵母菌種類來看，添加葡萄酒酵母時平均得分最高（10分），而添加葡萄酒酵母和不添加酵母時平均得分均為9分;從發(fā)酵溫度來看，發(fā)酵溫度25 ℃時平均得分最高（9分），發(fā)酵溫度21 ℃時平均得分最低（6分）;從發(fā)酵時間來看，發(fā)酵時間28 d時平均得分最高（9分），發(fā)酵時間7 d時平均得分最低（5分）。由此可見，當藍莓與紅糖質量比為1∶1，添加葡萄酒酵母，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時間為28 d時，藍莓酵素發(fā)酵液感官評價的綜合評分最高。

3 結論

筆者分別研究了藍莓與紅糖質量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、發(fā)酵溫度（21、23、25、27、29 ℃）、發(fā)酵時間（7、14、21、28、35、42 d）、添加酵母菌種類（不添加酵母、葡萄酒酵母、面包酵母）4個因素對藍莓酵素發(fā)酵液的影響，并記錄發(fā)酵液pH的變化，對試驗所得發(fā)酵產品的色澤、氣味及滋味進行感官評價，并結合超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除率為理化檢測指標進行分析，最終確定藍莓酵素發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)：發(fā)酵液pH最終穩(wěn)定在4.5左右，當藍莓與紅糖質量比為1∶1、發(fā)酵溫度為25 ℃、發(fā)酵時間為28 d、添加葡萄酒酵母時超氧化物歧化酶活性最高，DPPH自由基清除率最高，感官評分也最高。

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