HSP70及其磷酸化在下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥中的表達(dá)及臨床意義

霍鑫 曹治婷 蔡許超

[摘要] 目的 分析下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（LEASO）患者不同階段熱休克蛋白70（HSP70）及其磷酸化水平的差異及其臨床意義。 方法 收集2017年9月至2019年12月在柳州市人民醫(yī)院收治的80例下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（LEASO）患者的血樣，按踝肱指數(shù)（ABI）分為A組（ABI≤0.430）和B組（ABI>0.430）。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定本院患者各階段HSP70的表達(dá)，分析兩組HSP70濃度及ABI的差異。同時(shí)采集4例正常股動(dòng)脈標(biāo)本（正常組）和4例動(dòng)脈粥樣硬化性股動(dòng)脈標(biāo)本（病變組），用免疫印跡法檢測(cè)HSP70及其磷酸化HSP70（Ser15）、磷酸化HSP70（Ser78）和磷酸化HSP70（Ser82）。對(duì)正常組與病變組的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 A組HSP70濃度為（46.731±12.986）ng/mL，ABI為（0.231±0.056）。B組HSP70濃度為（67.104±18.262）ng/mL，ABI為（0.622±0.065）。正常組HSP70蛋白表達(dá)及磷酸化水平分別為（0.812±0.131） ng/mL、（0.643±0.107） ng/mL、（0.918±0.206） ng/mL和（0.891±0.168） ng/mL;病變組蛋白表達(dá)分別為（0.463±0.072） ng/mL、（0.424±0.081） ng/mL、（0.393±0.065） ng/mL和（0.572±0.101） ng/mL，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 血清HSP70濃度與LEASO嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，而HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)。病變組HSP70含量及其磷酸化水平明顯低于正常組，可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥;熱休克蛋白70;磷酸化;踝肱指數(shù)

[中圖分類號(hào)] R543.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）07-0062-04

Expression and clinical significance of HSP70 and its phosphorylation in arteriosclerosis obliterans of lower extremities

HUO Xin1? ?CAO Zhiting2? ?CAI Xuchao3

1.Department of Vascular Surgery，Liuzhou People′s Hospital in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou? ?545005， China; 2.Department of Radiology，Liuzhou People′s Hospital in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou? ?545005，China; 3.Department of Vascular Surgery， Hangzhou Geriatric Hospital， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To analyze the differences in heat shock protein 70（HSP70）and its phosphorylation levels in patients with lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO） at different stages， and its clinical significance. Methods Blood samples of 80 patients with lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO） who were admitted to Liuzhou People′s Hospital from September 2017 to December 2019 were collected and divided into group A （ABI≤0.430） and group B （ABI>0.430） according to the ankle-brachial index （ABI）. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the expression of HSP70 in patients in our hospital at various stages. The differences in HSP70 concentration and ABI between the two groups were analyzed. At the same time， four normal femoral artery specimens（normal group） and four atherosclerotic femoral artery specimens（pathological group） were collected. The HSP70 and its phosphorylated HSP70（Ser15）， phosphorylated HSP70（Ser78） and phosphorylated HSP70 （Ser82） were detected by Western blotting. The protein levels of the normal group and the diseased group were statistically analyzed. Results The concentration of HSP70 in group A was（46.731±12.986）ng/mL， and the ABI was （0.231±0.056）. The concentration of HSP70 in group B was（67.104±18.262）ng/mL， and the ABI was （0.622±0.065）. The protein expression and phosphorylation level of HSP70 in the normal group were （0.812±0.131）ng/mL， （0.643±0.107）ng/mL， （0.918±0.206）ng/mL and （0.891±0.168） ng/mL， respectively. The protein expression and phosphorylation level of HSP70 in the pathological group was（0.463±0.072）ng/mL， （0.424±0.081）ng/mL， （0.393±0.065）ng/mL and（0.572±0.101）ng/mL， there was significant difference between the two groups（P<0.05）. Conclusion Serum HSP70 concentration is negatively correlated with LEASO severity， while HSP70 concentration is positively correlated with ABI value. The HSP70 content and phosphorylation level of the diseased group is significantly lower than that of the normal group，which may be closely related to the occurrence and development of atherosclerosis.

[Key words] Lower extremity arteriosclerosis obliterans; Heat shock protein 70; Phosphorylation; Ankle-brachial index

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心、腦、四肢缺血的主要心血管疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致梗死。動(dòng)脈粥樣硬化已成為威脅人類健康的第一大殺手和世界上人類死亡的主要原因[1]。下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（Lower extremity arteriosclerosis obliterans，LEASO）是一種慢性進(jìn)行性疾病，其表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化，使下肢動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，管腔變窄甚至閉塞，進(jìn)而導(dǎo)致患肢間歇性跛行、靜息痛甚至潰瘍等一系列癥狀和體征壞死。動(dòng)脈粥樣硬化，尤其是LEASO，是一個(gè)復(fù)雜的炎癥過程，是冠狀動(dòng)脈疾病的主要潛在原因。目前對(duì)下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥發(fā)病機(jī)制的研究表明，內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的早期事件，與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展密切相關(guān)[2]。

熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是機(jī)體重要的應(yīng)激保護(hù)蛋白，廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中，在受到熱、氧化應(yīng)激或毒物刺激后迅速大量表達(dá)。熱休克蛋白按分子量可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱休克蛋白家族。HSP70是一種磷酸化熱休克蛋白，其是熱休克蛋白家族的一員[3]，在人冠狀動(dòng)脈中的表達(dá)模式與斑塊負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)。

HSP70的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化過程中可能降低，正常動(dòng)脈和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的培養(yǎng)表明，HSP70在正常動(dòng)脈中的含量較高[3]。股動(dòng)脈閉塞組與正常股動(dòng)脈造影結(jié)果比較，其HSP70表達(dá)明顯低于正常股動(dòng)脈硬化組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)合動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中HSP70的表達(dá)較低，動(dòng)脈粥樣硬化患者血清HSP70水平明顯低于健康對(duì)照組，提示血清HSP70水平可作為評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的指標(biāo)[4]。此外，差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，不穩(wěn)定斑塊的HSP70較穩(wěn)定斑塊顯著降低，提示HSP70在炎癥和氧化應(yīng)激中起重要作用，這可能與斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)[5]。較高的HSP70水平可以預(yù)測(cè)心臟病發(fā)作、中風(fēng)或降低心血管疾病死亡的風(fēng)險(xiǎn)[6]。此外，增加HSP70的含量可以減輕實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化，減輕炎癥，降低膽固醇水平，血漿HSP70水平可能是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在指標(biāo)[7]，血清HSP70水平可能是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)[8]。然而，目前尚不清楚HSP70及其磷酸化位點(diǎn)在疾病不同階段的表達(dá)差異及其作用。本研究的目的是進(jìn)一步闡明HSP70在不同類型和不同分期的LEASO患者中的表達(dá)差異及其磷酸化。此外，本研究旨在探討其在LEASO發(fā)揮的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2019年12月柳州市人民醫(yī)院80例LEASO患者未經(jīng)手術(shù)治療的臨床資料。LEASO 80例，因病截肢4例，創(chuàng)傷性截肢4例。所有參與者在研究開始前給予知情同意，本研究獲得柳州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采集空腹血樣。Fontaine分期：Ⅰ期，無(wú)癥狀7例;Ⅱa期，輕度間歇性跛行18例;Ⅱb期，中度至重度間歇性跛行24例;Ⅲ期，缺血性靜息27例;Ⅳ期，潰瘍及壞疽4例。根據(jù)踝肱指數(shù)（Ankle brachial index，ABI），將80例患者分為A組（ABI≤0.430）和B組（ABI>0.430），每組各40例。A組男35例，女5例，年齡40～65歲;B組男37例，女3例，年齡41～67歲。8例截肢患者中4例為外傷患者（正常組），4例為動(dòng)脈粥樣硬化患者（病變組）。采集股動(dòng)脈標(biāo)本。正常組男3例，女1例，年齡38～65歲，因外傷不能保留患肢;病變組男2例，女2例，年齡43～70歲，均為壞疽，手術(shù)治療無(wú)效。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）? 從我院快速采集血液樣本，并在4℃下保持8～12 h。之后，從血液樣本中分離血清，并保存于-20℃下以供進(jìn)一步研究。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國(guó)紐約創(chuàng)新診斷公司），根據(jù)制造商的方案檢測(cè)80例LEASO患者血樣中HSP70。

1.2.2免疫印跡法? 通過添加Sigma從血樣中分離總蛋白。蛋白質(zhì)提取液用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)染到PVDF膜（微孔膜）上。用5%（w/v）試劑級(jí)脫脂乳封閉膜，并用主要抗體[包括HSP70（ab12351）、磷酸化HSP70（Ser15）（CST，2406T）、磷酸化HSP70（Ser78）（CST，2215）和磷酸化HSP70（Ser82）（CST，2435）]在4℃下培養(yǎng)過夜，然后進(jìn)行二級(jí)抗體培養(yǎng)。蛋白質(zhì)條帶用CLARITYTM Western ECL底物（Bio-Rad）顯示。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)HSP70濃度與ABI和Fontaine分期進(jìn)行相關(guān)性分析。此外，還對(duì)4例正常股動(dòng)脈標(biāo)本（正常組）和4例動(dòng)脈粥樣硬化性股動(dòng)脈標(biāo)本（病變組）中HSP70和磷酸化HSP70（Ser15）、磷酸化HSP70（Ser78）和磷酸化HSP70（Ser82）的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以[n（%）] 表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fontaine分期與ABI和HSP70濃度的相關(guān)性

在80例LEASO患者中，F(xiàn)ontaine分期[1]中Ⅱa期、Ⅱb期、Ⅲ期、Ⅳ期HSP70濃度均與Ⅰ期比較，F(xiàn)ontaine分期越晚，HSP70濃度越低，ABI也同樣，均呈負(fù)相關(guān)。

另外，通過對(duì)HSP70濃度與不同ABI的關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)B組HSP70濃度和ABI均顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 正常組與病變組HSP70蛋白表達(dá)及其三個(gè)磷酸化位點(diǎn)比較

病變組HSP70蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

目前關(guān)于 LEASO 發(fā)生機(jī)制的研究表明[9]，內(nèi)皮功能障礙是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的早期事件，其與動(dòng)脈粥樣斑塊的進(jìn)展有重要關(guān)系。近年來(lái)，“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”受到了廣泛關(guān)注，另一種主要學(xué)說是脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)[10]，合并冠狀動(dòng)脈疾病的LEASO比率明顯高于其他疾病，高達(dá) 70%。HSP是指細(xì)胞在應(yīng)激源特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)。HSP在生物界中的一個(gè)重要特點(diǎn)是其在進(jìn)化過程中的高度保守性。從大腸桿菌、酵母、果蠅和人體分離的分子量為70 kD的HSP，如果對(duì)其進(jìn)行全氨基酸序列分析，就可發(fā)現(xiàn)其具有80%以上的相似性[11]。HSP在進(jìn)化過程中的高度保守性，說明其具有普遍存在的重要生理功能，而HSP70與動(dòng)脈硬化閉塞癥之間的關(guān)系十分密切。

在生理?xiàng)l件下，當(dāng)細(xì)胞處于非應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HSP70的表達(dá)量較低，主要以大分子聚合物的形式存在，一般不活躍，主要作為分子伴侶調(diào)節(jié)肽的運(yùn)輸、折疊和組裝[12]。當(dāng)細(xì)胞受到生物或物理因素的刺激時(shí)，HSP70的表達(dá)增加，大分子聚合物解聚形成低聚物，主要受HSP70分子磷酸化的調(diào)控，HSP70有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括Ser15、Ser78和Ser82，其中Ser78和Ser82位于C端，Ser15位于N端。最新證據(jù)表明，磷酸化的HSP70是一種有效的抗凋亡分子[13]。在高膽固醇飲食誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化模型中，46種蛋白在主動(dòng)脈組織中表達(dá)差異，磷酸化的HSP70水平降低[14]。磷酸化HSP70在正常動(dòng)脈內(nèi)膜標(biāo)本的條件培養(yǎng)基中含量豐富，而在動(dòng)脈粥樣硬化條件培養(yǎng)基中卻很少發(fā)現(xiàn)。心肌活檢顯示，動(dòng)脈粥樣硬化患者HSP70的磷酸化水平比正常人低20倍左右[15]。

然而，由于目前尚不清楚HSP70與LEASO不同F(xiàn)ontaine分期的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，LEASO階段越高，ABI越低，HSP70濃度越低;相反，LEASO階段越低，ABI越高，HSP70濃度越高。以往對(duì)ABI的研究結(jié)果一致認(rèn)為，ABI在LEASO缺血評(píng)估中具有重要價(jià)值，準(zhǔn)確性高[15]。HSP70濃度越高，相應(yīng)的ABI值越高;HSP70濃度越低，對(duì)應(yīng)的ABI值越低。因此，可以得出HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)的結(jié)論。此外，ABI的大小反映了LEASO的嚴(yán)重程度，即患者ABI越低，病情越嚴(yán)重，HSP70濃度越低。當(dāng)HSP70濃度升高時(shí)，病情發(fā)展緩慢，反之亦然。因此，HSP70可作為評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的生物學(xué)指標(biāo)，表明血清HSP70濃度與LEASO嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)病變組HSP70及其3個(gè)磷酸化位點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平均顯著低于正常組（P<0.05）。也就是說，動(dòng)脈粥樣硬化患者股動(dòng)脈中HSP70的含量及其磷酸化程度明顯低于正常人股動(dòng)脈。目前，關(guān)于正常人HSP70及其磷酸化含量的報(bào)道很少。本研究測(cè)定了血樣中HSP70的濃度和蛋白表達(dá)，并分析了HSP70濃度與ABI或Fontaine分期的相關(guān)性。本研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究HSP70在LEASO患者中的作用提供了很好的幫助。

綜上所述，血清HSP70濃度與LEASO嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，而HSP70濃度與ABI值呈正相關(guān)。HSP蛋白的大量表達(dá)可能與人股動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。這將為今后研究LEASO的診斷、發(fā)病機(jī)制和治療奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-08-17）