UPLC-MS／MS法可同時測定化妝品中8種大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類抗生素

王寧 章宦勝 隋玉杰 唐玉紅

目前的化妝品抽檢主要是以《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）為依據(jù)，其中僅提供了部分抗生素的檢測方法，如甲硝唑、氯霉素、鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素等，對于大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類抗生素，檢測方法尚未涉及。作者選取了乳液和面霜類化妝品樣品，對化妝品中8種大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類抗生素的檢測方法進(jìn)行了系統(tǒng)性試驗，證明這種方法操作簡單、分離效率高、回收率穩(wěn)定，可有效為化妝品中多種抗生素檢測提供技術(shù)支持，也可為化妝品中抗生素測定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

抗生素由于其良好的抗菌作用和非特異性抗炎作用，在皮膚科治療中表現(xiàn)出較好的療效。一些化妝品生產(chǎn)者利用這類物質(zhì)的治療特性，向化妝品（特別是祛痘類化妝品）中非法添加抗生素，以呈現(xiàn)又快又好的效果，而《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）將抗生素規(guī)定為禁用物質(zhì)，原因在于抗生素長期使用可能造成耐藥性、菌群失調(diào)，甚至損害肝腎功能等后果。在近幾年國家藥品監(jiān)督管理局對化妝品的抽查中發(fā)現(xiàn)，抗生素檢出頻頻出現(xiàn)，2018年初即公布了21批次祛痘化妝品的抗生素檢出情況。但是，目前的化妝品抽檢主要是以《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）為依據(jù)，其中僅提供了部分抗生素的檢測方法，如甲硝唑、氯霉素、鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素等，對于大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類抗生素，檢測方法尚未涉及。而大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類抗生素是皮膚科較為常用的兩類藥物：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有優(yōu)良的抗炎作用，已被廣泛應(yīng)用于銀屑病、痤瘡、玫瑰糠疹、酒渣鼻等皮膚病的治療中;林可胺類抗生素則被各大醫(yī)院用于制成治療痤瘡、皮膚分泌異常等疾病的制劑，療效顯著。一些化妝品中若添加了這兩類抗生素，則會因為沒有相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)而躲避監(jiān)管部門的檢查，因此有必要通過研究建立兩類抗生素的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。目前，已有少量文獻(xiàn)報道了對化妝品中部分林可胺類抗生素進(jìn)行測定的方法，如克林霉素、林可霉素等，方法主要為液相色譜法和液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法因其高分離、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、專屬性強(qiáng)等特點，在化妝品抗生素檢測方法研究方面應(yīng)用越來越廣泛。本研究采用超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法（UPIC-MSIMS）對化妝品中的紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯同時進(jìn)行測定。該方法的建立可為化妝品質(zhì)量安全監(jiān)控提供技術(shù)支持。

本文采用超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法建立了對化妝品中8種大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類抗生素（紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯）同時進(jìn)行測定的方法。樣品經(jīng)乙腈渦旋分散、超聲、冰浴處理、離心、上清液稀釋過濾后進(jìn)行UPLC-MS/MS儀器分析。8種抗生素在5-100 Ug/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997，檢出限為1-20 Ug/kg。8種被測物質(zhì)的平均加標(biāo)回收率為80.0%～106.9%，精密度為0.6%-10.9%。該方法操作簡單高效、穩(wěn)定性好，可用于化妝品中抗生素的快速測定。

一、測定儀器與試劑

1.主要試驗儀器

超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀（1290 Infinity11/6495，Agilent Technologies，Inc.）、渦旋振蕩器（VortexTM-1， WiggensGmbH）、超聲波發(fā)生器（P120H，ElmaSchmidbauer GmbH）、高速離心機(jī)（3K15，SigmaLaborzentrifugen GmbH）、 電子天平（CPA225D，Sarto rius G roup）。

2.主要試劑

紅霉素、克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer GmbH），阿奇霉素、羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜實驗科技股份有限公司），林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯對照品（中國食品藥品檢定研究院），吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)品（Toronto ResearchChemicals Inc.），甲醇、乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司），甲酸（色譜純，北京百靈威科技有限公司）。

3.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別稱取適量的紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于甲醇中，配制成濃度為1000mg/L的單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別吸取0.1 mL各單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于IO mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為IO mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：吸取I.O mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于IO mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為l mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取5 UL、10 UL、20 UL、50uL、100 UL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用空白樣品前處理所得基質(zhì)溶液定容至1.0 mL，配制成5 Ug/L、10 Ug/L、20 ug/L、 50Ug/L、 100 Ug/L濃度系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

二、試驗方法

1.樣品前處理

稱取樣品Ig（精確至l mg）置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈后密閉，渦旋使之分散均勻，超聲提取10min。冰浴處理20 min，在5。C下以7000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取500 UL上清液于5mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，所得稀釋液用0.22 um有機(jī)濾膜過濾凈化，移取適量凈化后溶液至進(jìn)樣瓶中密封，供UPLC-MS/MS測定。

2.色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus Cl8 （3.0 mmXlOO mm，3.5 um）;進(jìn)樣量：5 uL;流速：0.2 mL/min;柱溫：30℃;流動相：A：0 .1%甲酸水溶，B：乙腈;梯度洗脫程序見表L后運行時間為2 min。

3.質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源;掃描方式：正離子掃描;監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;毛細(xì)管電壓：4000 V;干燥氣溫度：200℃;干燥氣流速：II L/min;霧化器壓力：35 psi。各被測物質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表2，所得8種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的MRM譜圖如圖l所示。

三、結(jié)果與討論

1.線性范圍與檢出限

采用確定好的儀器方法，對按照標(biāo)準(zhǔn)溶液的配比步驟配制成的5 ug/L、10 u9/L、20 ug/L、50 ug/L、100 ug/L濃度系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS測定。以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)、各被測物質(zhì)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得8種被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程見表3。由表3可以看出，8種被測抗生素在5-100 Ug/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997。通過對空白樣品加入濃度逐漸降低的標(biāo)液進(jìn)行試驗測定的方法，并以信噪比3為條件確定檢出限，所得8種被測物質(zhì)的檢出限見表3，為1-20 ug/kg。

2.回收率與精密度

采用乳液類和面霜類空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，添加水平為0.5 mg/kg、 2.5 mg/kg和5 mg/kg，每個樣品每個添加水平開展6次獨立重復(fù)試驗，所得平均回收率和精密度見表4，其中精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。從表4的結(jié)果來看，8種被測抗生素的平均回收率為80.0%-106.9%，精密度為0. 6%-10.9%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度較高，精密度良好。

3.實際樣品的檢測

通過網(wǎng)絡(luò)購買收集了20批次化妝品，主要為標(biāo)稱具有祛痘、修護(hù)、敏感肌護(hù)理等功效的乳液和面霜類產(chǎn)品。用本研究方法對該20批次樣品進(jìn)行8種大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類抗生素測定，結(jié)果顯示：1批次面霜樣品有克林霉素磷酸酯檢出，l批次面霜樣品中有林可霉素檢出。

小結(jié)

本研究利用超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法實現(xiàn)了對化妝品中8種大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類抗生素的測定。本研究建立的試驗方法操作簡單，可在短時間內(nèi)達(dá)到8種被測物質(zhì)的有效分離，在5-100 ug/L濃度范圍表現(xiàn)出良好的線性，回收率穩(wěn)定、準(zhǔn)確高效。該方法可為化妝品中多種抗生素檢測提供技術(shù)支持，也可為化妝品中抗生素測定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。編后語

這篇論文看似專業(yè)，實際上不是為了試驗而試驗，而是著眼于實用，以消費者用妝安全和化妝品抽檢方法的完善為目的。言有限，而思無限。大眾消費者，無論是關(guān)注產(chǎn)品成分與功效的“成分黨”“功效黨”，還是緊跟消費潮流的消費者，通過這篇論文可以看到中國化妝品人在市場背后的思考與努力，提高對中國化妝品法規(guī)與監(jiān)管等的信心。化妝品生產(chǎn)商、品牌商、經(jīng)銷商等亦可收獲警醒之心，國家與業(yè)內(nèi)專家一直致力于完善化妝品監(jiān)管的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)與方法，可鉆的空子越來越少，唯有合法合規(guī)方是正道。CCR

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部化妝品安全技術(shù)規(guī)范[M]北京：中國衛(wèi)生出版社.2015：24

[2]朱俐，劉洋，曾三平，等.化妝品中有害物質(zhì)分析檢測方法研究進(jìn)展[J]分析測試學(xué)報，2016，35（2）：185-193

[3]鐘連生，馬道銘大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗炎作用機(jī)制的進(jìn)展及在皮膚科的應(yīng)用[J]國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，2004，30（5）：273-275

[4]于珥，龐學(xué)斌，馮豐湊，等市售祛痘類化妝品中非法添加克林霉素的現(xiàn)狀分析[J]今日藥學(xué)，2013，23（7）：436-437+441

[5]鄭榮，王柯除螨祛痘類化妝品中林可霉素和克林霉素的測定[J]中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014，24（5）：677-678+681

[6]陳張好，方繼輝，劉小娟高效液相色譜法測定化妝品中林可霉素類藥物[J]理化檢驗化學(xué)分冊，2014，50（2）：252254

[7]簡龍海，鄭榮，鐘吉強(qiáng)，等LC-MS/MS法同時測定祛痘類化妝品中林可霉素等20種禁用物質(zhì)[J]分析試驗室，2014，33（12）：1459-1462

[8]張燕惠，李玲玲，王紅梅高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中10種抗生素[J]中國衛(wèi)生檢驗雜志，2017，27（18）：26002602